實驗目的：
明確培養基的配製原理；通過對LB培養基的配製，掌握配製培養基的一般方法和步驟；掌握細菌的接種、培養的無菌操作方法和步驟。
實驗原理：
重組DNA分子（質粒、噬菌體、粘性質粒）必須導入宿主菌中，通過細菌培養來擴增所需的重組DNA。
大腸杆菌與其它微生物一樣，都具有穩定遺傳性和變異性、遺傳性，保證微生物本身特征的相對穩定，即無性繁殖過程中能夠保持原有的性狀，為菌種保藏提供了有利因此。
菌種保藏的原理是：通過低溫、幹燥、隔絕空氣和斷絕營養等手段，以達最大限度地降低菌種的代謝強度，抑製細菌的生長和繁殖。由於菌種的代謝相對靜止，生命活動將處休眠狀態，從而可以保藏較長時間。要求保存的菌種在複蘇後除保持以前的生活與繁殖能力、不發生形態特征、生理狀態及遺傳性狀的改變外，還不允許汙染任何雜菌。此外，在保存前應確保菌種的單純性，先分離單菌落後進行鑒定，然後再繁殖保存。
常用的長期保存法有：液體石蠟法、矽膠保存法、加入甘油或二甲基亞碸（DMSD）等保護劑。目前比較常用的甘油低溫保存法(-70~-196)℃，由於在-70℃或液氮中凍存，細菌內的酶活性均己停止，即代謝處於完全停止狀態，故可以長期保存。在0~-70℃溫度範圍內，水晶呈針狀，極易招致細菌的嚴重損傷。用電鏡觀察，可見細菌的核膜上有大量針尖樣小孔。因此，為了避免0~-70℃冰晶的形成和細菌膜兩側離子平衡的破壞，需要加保護劑。甘油可降低冰點，在緩慢的凍結條件下，能使細菌內水分在凍結前透出細菌外。貯存在-70℃以下低溫中能減少冰晶形成，甘油對細菌無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細菌。甘油的使用濃度範圍為15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混勻後貯存於-70℃或液氮中。複蘇後細菌仍能生長，活力不受任何影響。
培養基是人工地將多種物質按各種微生物生長的需要配製而成的一種混合營養基質，用以培養或分離各種微生物。因此，營養基質應當有微生物所能利用的營養成分（包括碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素）和水。按培養基的物理狀態分液體培養基和固體培養基。固體培養基是在液體培養基中加入凝固劑即為固體培養基。實驗用的凝固劑有瓊脂、明膠和矽膠，後者用於配製自養微生物的固體培養基。對其他多數微生物來講，以瓊脂最為合適，一般加入1.5~2.5%即可凝固成固體。此培養基可供分離、鑒定、活菌計數、菌種保藏等用。液體培養基是沒有加瓊脂，配好後成液體狀態培養基。常用於生理代謝的研究和工業發酵等。
LB（Luria-Bertani）培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時又稱為普通培養基。它含有酵母提取物、蛋白腖和NaCl。其中酵母提取物為微生物提供碳源和能源，磷酸鹽、蛋白腖主要提供氮源，而NaCl提供無機鹽。在配製固體培養基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96℃時溶化，一般實際應用時在沸水浴中或下麵墊以石棉網煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養基中瓊脂的含量根據瓊脂的質量和氣溫的不同而有所不同。由於這種培養基多用於培養細菌，因此，要用稀酸或稀堿將其pH調至中性或微堿性，以利於細菌的生長繁殖。
實驗材料：
[1].大腸杆菌菌株：DH5α
[2].酵母提取物（Yeast extract）
[3].蛋白腖（Tryptone）
[4].NaCl
[5].瓊脂 (agar)
[6].1M NaOH
[7].1M HCl
[8].0.1M CaCl2：在100ml純水中溶解2.8gCaCl2.6H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成10ml小份，-20℃凍存。
[9].37℃培養箱、試管，三角燒瓶，燒杯，培養皿（9cm），量筒，玻棒，培養基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.5~9.0），棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩等。
實驗步驟：
1、LB培養基的準備
[1].稱量：準確地稱取酵母提取物5g、蛋白腖10g、NaCl 10g，放入燒杯中。蛋白腖很易吸潮，在稱取時動作要迅速。
[2].溶化：加入800ml ddH2O，用磁力攪拌子攪拌溶解。
[3].調pH：先用精密pH試紙測量培養基的原始pH值，如果pH偏酸，用1M NaOH調節pH達7.0。反之，則用1M HCl進行調節。注意pH值不要調過頭，以避免回調，否則，將會影響培養基內各離子的濃度。pH調節好之後，用ddH2O定容到1000ml。如果要配製固體LB培養基，1000ml液體培養基加入15 g瓊脂。
[4].分裝：按實驗要求，將液體培養基分裝入試管內或三角燒瓶內。分裝過程中注意不要使培養基沾在管口或瓶口上，以免沾汙棉塞而引起汙染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌後製成斜麵，分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌後垂直待凝。
[5].加塞：培養基分裝完畢後，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養基內而造成汙染，並保證有良好的通氣性能。
[6].包紮：加塞後，將全部試管用麻繩捆紮好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩紮好。用記號筆注明培養基名稱、組別、日期。三角燒瓶加塞後，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式紮好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養基名稱、組別、日期。
[7].滅菌：將上述培養基以0.1~0.165 MPa (120~130)℃高壓蒸汽滅菌20min。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內暫存。
[8].擱置斜麵：將滅菌的試管培養基冷至50℃左右，將試管棉塞端擱在玻棒上，擱置的斜麵長度以不超過試管總長的一半為宜。
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