由於細菌感染而致病的各種標本及帶菌者所需檢查的各種標本，往往並非單一的細菌，而混有其它非致病菌（人體正常菌群）。因此當對此標本須作出細菌鑒定時，就必須從標本中分離出致病菌，稱為細菌分離培養技術。另外，對已得到可疑病菌進行細菌鑒定及菌種保存等培養，稱為純培養接種技術。
（一）平板劃線接種法（又稱分離培養法）
平板劃線接種法為最常用的分離培養細菌的方法，通過平板劃線後，可使細菌分散生長，形成單個菌落，有利於從含有多種細菌的標本中分離出目的菌。平板分離劃線的方法較多，其中以分區劃線法與曲線劃線法較為常用。其目的都要使細菌呈現單個菌落生長，便於同雜菌菌落鑒別。現隻介紹分區劃線法。
1、右手持接種環，經火焰滅菌，待涼後，挑取大腸杆菌（或葡萄球菌）培養物少許。
2、左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，於火焰近處將菌塗於瓊脂平板上端，來回劃線，塗成薄膜（約占平板總表麵積的 1/10），劃線時接種環與平板表麵成30~40º角，輕輕接觸，以腕力在平板表麵行輕快地滑移動作，接種環不應劃破培養基表麵。
3、燒灼接種環，殺滅環上殘留細菌，待冷（是否冷卻，可先在培養基邊緣處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續平行劃線，約占平板表麵1/5左右，再次燒灼接種環，等三次平行劃線……以同樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表麵劃完。
4、劃線完畢，蓋上平皿蓋，底麵向上，用標簽或臘筆注明菌名檢驗號碼，接種者信息等，置37℃孵育培養24小時後觀察結果。
（二）純培養細菌接種法（斜麵培養基接種法：用於培養，保存菌種及其它實驗用）
1、取一支斜麵培養基及一支純菌種管，並排傾斜放在左手四指中拇指壓住並以手掌支住兩試管底部。右手將白金環於火焰上滅菌、冷卻。並拔起兩試管的棉塞。（勿放置桌上，如棉塞太緊時應預先鬆動）。
2、試管口部於火焰上往返通過2~3次滅菌，將滅菌白金環伸入有菌試管中，取少量細菌（一般應從斜麵底部沾取），然後小心移至準備接種的試管中。
3、接種方法是自管底向上連續平劃線，若以保存菌為目的時可自管底上劃一粗直線即可。
4、取出接種環，將試管上部再經火焰滅菌，塞好棉塞，接種環滅菌後放回原處。
5、若自平皿培養物中取菌時，隻應沾取一個單個菌落。
6、接種菌應作好標記，標明菌種名稱，日期等，置37℃溫箱中培養，次日觀察結果。
液體培養基接種法：用於增菌及鑒定細菌生長特點，如表麵生長，沉澱生長，均勻混濁生長等。操作技術基本與上法相同，隻是接種時應將沾菌之接種環沿接近液體表麵之管內壁輕輕摩擦（勿用力振蕩）使細菌混入培養基內，置37℃溫箱中培養，次日觀察結果。
（三）半固體培養基穿刺培養法
用於保存菌種及間接觀察細菌之動力（無動力之細菌僅沿穿刺線生長，清晰可見；有動力的細菌使培養基呈現混濁樣，穿刺線甚至難以看出）。
用無菌操作技術，滅菌穿刺針沾取細菌後，垂直刺入半固體培養基中央直達近管底處，再沿原穿刺線抽出即可，置37℃溫箱培養，次日觀察結果。
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