病原菌的分離鑒定及其疫苗的製備(1)

 

熟悉水產細菌性病原的分離、培養、純化與鑒定的基本方法，了解所分離細菌性病原的形態特征及培養特點，了解細菌性滅活疫苗製備的基本過程。

 

患白內障病虎紋蛙（或其他患細菌性疾病的水產動物）、健康虎紋蛙、腦膜炎敗血黃杆菌（虎紋蛙白內障病的病原）

 

2216E 瓊脂平板、 2216E 瓊脂斜麵、福爾馬林、無菌蒸餾水、生理鹽水、磷酸緩衝液、接種環、解剖刀、剪刀、鑷子、滴管、紗布、白瓷盤、酒精棉球、滅菌試管、 96 孔板、注射器、酒精燈、離心機（包括離心管）、水族箱、記號筆

 

（一）病原菌的分離與鑒定

（ 1 ）普通肉湯培養基：

按以下劑量稱取各種試劑（先稱取鹽類再稱蛋白腖及牛肉膏），置於鋁鍋或搪瓷缸中。

牛肉膏 5g 磷酸氫二鉀 1g

蛋白腖 10g 蒸餾水 1000ml

氯化鈉 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6

初配好的培養基呈酸性故要用 NaOH 調整。將 pH 測定後的肉湯培養基用濾紙過濾，將過濾好的肉湯分裝試管、鹽水瓶、三角燒瓶等容器，待滅菌。

 

（ 2 ）普通營養瓊脂培養基

普通肉湯 1000ml

瓊脂 20g

瓊脂是由海藻中提取得一種多糖類物質，對病原性細菌無營養作用，但在水中加溫可融化，冷卻後可凝固。在液體培養基中加入瓊脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培養基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％則成半固體培養基。

 

將稱好的瓊脂加到普容肉湯中，加熱煮沸，待瓊脂完全融化後，將 pH 調至 7 . 4 ～ 7 . 6 。瓊脂融化過程中需不斷攪拌，並控製火力，不使培養基溢出或燒焦，並注意補充蒸發掉的水份。

 

加熱溶解好的培養基可用濾紙進行過濾，固體培養基要用 4 層紗布趁熱過濾（切勿使培養基凝固在紗布上），之後按實驗要求，將配製好的培養基分裝入試管或三角瓶中，包紮好待滅菌，將培養基置於高壓蒸汽鍋內， 121 ℃ 滅菌 15 ～ 30min ，趁熱將試管口一端擱在玻棒上，使之有一定斜度，凝固後即成普通瓊脂斜麵，也可直立，凝固後即成高層瓊脂。

 

鹽水瓶中的普通瓊脂以手掌感觸，若將瓶緊握手中覺得燙手，但仍能握持者，此即為傾倒平皿的合適溫度（ 50 ～ 60 ℃ ），每隻滅菌培養皿倒入約 15 ～ 20ml ，將皿蓋蓋上，並將培養皿於桌麵上輕輕回轉，使培養基平鋪於皿底，即成普通瓊脂平板。

 

培養基中的某種成分，如血清、糖類、尿素、氨基酸等在高溫下易於分解、變性，故應過濾除菌，再按規定的量加入培養基中。

 

 

分離病原菌的材料要求是具有典型患病症狀的活的或剛死不久的患病生物，病原菌的分離方法如下。

 

體表分離：先將病灶部位表麵用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或 用經酒精燈灼燒的解剖刀燙燒消毒，再 用接種環刮取病灶深部組織或直接挑取部分深部患病組織，接種於普通肉湯培養基增菌或直接在普通瓊脂平板上劃線分離。

 

內部組織器官：用 70 ％酒精浸過的紗布覆蓋體表或用酒精棉球擦拭，進行體表消毒，無菌打開病魚的腹腔，以肝、腸、心髒等髒器為材料， 先將擬分離病原的部位表麵用 70% 酒精棉球擦拭或用 經火焰上灼燒後的解剖刀燙燒，以殺死表麵的雜菌，隨即在燒灼部位刺一小孔，用滅菌的接種環（待冷 2 ～ 5 秒）伸向燒灼部小洞中，用手指將接種環輕輕旋轉兩次，借以達到取足材料的目的。左手持握普通瓊脂平板，並靠近火焰，右手持取材後的接種環在瓊脂平板上分區劃線接種。劃線時接種環麵與平板表麵成 30 ～ 40 度的角輕輕接觸，在平板表麵輕快地移動，接種環不應嵌入培養基內，且不要重複，否則形成菌苔。劃線完畢，蓋上皿蓋，接種環滅菌後放下，並在平皿底部用記號筆注明接種材料、日期及操作者代號。也可對實質性髒器用無菌剪刀下一小塊，用鑷子夾住病料使其剖麵接觸潔淨的玻片，作多個觸片，染色後在顯微鏡下直接鏡檢，能快速獲得結果。

 

鰓部：用無菌接種環刮取鰓上的分泌物劃平板。

 

血液及體液：用無菌注射器吸取病魚血液和體液，滴於平板塗布；或用滅菌後的接種環挑取血液和體液後於平板上劃線，分離細菌。

接種後的平板經 30 ℃ 左右培養 24 ～ 72h 後， 檢查菌落生長情況，對菌落檢查的主要內容包括：

（ 1 ）大小：其大小以 mm 表示，微小菌落：針尖大，直徑小於 0 . 5mm ，如支原體菌落、豬丹毒杆菌菌落；小菌落：直徑在 0 . 5 ～ 1 mm 之間，如嗜血杆菌、布氏杆菌菌落；中等大小的菌落：直徑在 1 ～ 3 mm 之間，如巴氏杆菌、沙門氏杆菌菌落；大的菌落：直徑大於 3mm ，如炭疽芽孢杆菌菌落等。

（ 2 ）形態：圓形，不規則形（根狀、樹葉狀）

（ 3 ）邊緣：整齊，不整齊（鋸齒狀、蟲蝕狀、卷發狀）

（ 4 ）表麵：光滑、粘液狀、粗糙、荷包蛋狀、漩渦狀、顆粒狀

（ 5 ）隆起度：隆起，輕度隆起，中央隆起，平升狀、扁平狀，臍狀（凹陷狀）

（ 6 ）顏色：無色、灰白色、白色、金黃色、紅色、粉紅色

（ 7 ）透明度：透明、半透明、不透明

（ 8 ）溶血性： β －溶血（完全溶血）， α －溶血（不完全溶血），不溶血

根據菌落數量和特征，挑選可能的病原菌菌落進一步劃線純化 1 ～ 2 次後，將經純化的可能病原菌用於感染試驗。

 

將從患病材料中分離的所有可能病原菌經純化和擴大培養後分別進行人工感染實驗。目前最常用的人工感染接種方法有浸泡、口服和注射法等，究竟選用哪一種方法最合適，需要根據不同的疾病類型和可能的侵入途徑而定。如體表的病，可采用浸泡法（包括創傷浸泡）；體內的疾病，可采用口服、注射法。由於絕大部分病原菌都是條件致病菌，因此在人工感染實驗時還要注意感染菌的用量，接種量過大，即使該菌並不是引起實驗材料致病的病原菌，也可能會因大量菌體裂解釋放的大量內毒素而使感染生物死亡，為了量化感染菌的危害程度，可以測定感染細菌對接種動物的半數致死量（ LD 50 ），根據 LD 50 的大小來判斷其致病力的強弱。隻有 LD 50 相對較低、感染引起的死亡與實驗材料有相同症狀、並且經回接實驗還能分離到相同的細菌時，才能確定所分離的細菌為引起實驗材料致病的病原。

 

在感染實驗時，感染對象要求是沒有患病史的同種生物，在感染前要經過 1 ～ 2 周的暫養，感染數量要 30 尾以上（至少要 10 尾以上）。必要時，還要將溫度控製在適合疾病爆發的水平。感染過程中要 定時投餌和換水，同時安排合適的對照組。

 

分別觀察病原菌的形態以及檢測其各種生理生化指標，通過查閱伯傑氏手冊確定病原菌的種類；也可直接用細菌鑒定儀測定病原菌的種類。