細菌和噬菌體的遺傳分析（2）

細菌和噬菌體等原核生物的遺傳重組是指受體中插入來自供體的遺傳性不同的DNA片段，並把這種DNA片段或它的複本整合為受體基因組的一部分。受體的遺傳重組可以通過三種途徑來實現：

 

轉化（transformation）：遊離的細菌DNA片段被吸收到不同的細菌細胞內（受體）

接合（conju gation）：通過供體與受體細胞之間的接觸而傳遞DNA

轉導（transduction）：一種細菌的DNA片段經過溫和的或有缺陷的噬菌體傳遞給另一種細菌

 

在細菌中轉化很可能是十分普遍的現象。前人的研究發現鏈球菌屬、嗜血杆菌屬、芽孢杆菌屬、奈瑟氏球菌屬、假單孢杆菌屬和大腸杆菌屬的細菌都可以轉化。

 

能吸取DNA分子而被轉化的細菌細胞叫做感受態細胞（competent recipient cell），在某一細菌群體中，隻有極少數細胞是感受態的，它們具有感受因子，可能是細胞表麵的一種蛋白質或是一種轉化酶，它參與了DNA的吸收。

 

轉化過程可分為幾個步驟： 

 

（1）雙鏈DNA分子和細胞表麵感受位點可逆性的結合；

（2）供體DNA片段被吸入受體細胞；

（3）侵入受體細胞的供體雙鏈DNA轉變成單鏈形式，其中的一條鏈被降解；

（4）未被降解的一條鏈部分或整個插入受體細胞的DNA鏈，形成雜合的DNA分子；

（5）雜合DNA複製後，形成一個親代類型的DNA和一個重組類型的DNA並導致轉化

 

F因子是細菌中獨立染色體外可複製的質粒，為一環狀DNA，包括原點、配對區和致育基因。F因子上大部分區域叫育性區或育性基因，負責大腸杆菌的育性。含有育性區的大腸杆菌在細胞表麵有很多毛狀的性纖毛（或性傘毛）。

 

A菌株中的F質粒通過配對區可和大腸杆菌染色體的某些區域配對，配對後即可交換，便整合到大腸杆菌染色體上。這種既可以整合又可以遊離的質粒叫附加體。 

 

 

含有遊離狀態的F因子叫F⁺，沒有的叫F^-，含有整合狀態的叫Hfr（高頻重組）。大量混合後，隻有F⁺×F^-，Hfr×F^-能雜交，而F⁺×F⁺，F^-×F^-，Hfr×Hfr，Hfr×F⁺都不能雜交。因此大腸杆菌的和相當於高等植物的雌雄配子。

 

F⁺菌株和F^-菌株靠近→細胞膜融合→兩細胞間形成接合管。然後， F因子從原點斷裂，以原點為先導，邊複製邊轉移（因此叫滾環複製），複製後的F因子轉移到另一個細胞中。最後，細胞分開，使F^-變成F⁺。

F因子可整合在大腸杆菌不同的部位，由於整合的部位不同，方向不同，則形成了不同的Hfr。

 

在Hfr×F^-雜交過程也是先形成接合管，然後Hfr邊複製邊轉移，轉移的順序：原點—配對區—大腸杆菌基因—配對區—育性基因。在轉移過程中，結合管很易破裂，這樣轉移到受體的部分隻是靠近原點的一部分（全部轉移需溫和條件120分鍾），形成部分二倍體：一個完整的基因組和一個不完整的基因組所構成的二倍體。在部分二倍體中，受體的基因組叫內基因子，供體的基因組叫外基因子。外基因子轉移到受體以後：遊離。隨著細胞分裂代數的增加被稀釋，消失；與內基因子發生交換、重組。奇數交換，形成一個線狀分子，在大腸杆菌中不能複製，導致細胞死亡；偶數交換，形成線狀分子（不能複製，消失）和環狀分子。大腸杆菌複製時，DNA複製酶隻能識別環狀分子。其中原點有273bp，富含AT，首先解旋成“眼”狀結構，然後雙向複製。

 

（1）基因重組發生在部分二倍體中（自然狀態下很難把供體基因全部轉移過來）

（2）奇數交換無效，偶數交換有效。

（3）隻出現一種重組子（雜交後代），真核生物出現四種雜交後代。

（4）在F⁺×F^-中，結果使F^-變為F⁺，很少發生基因重組（供體與受體之間）

因為F⁺大部分是遊離的，不轉移，隻有個別的細胞是整合狀態。隻有整合的才能轉移，進行基因重組。

（5）在Hfr×F^-中，F^-很少變成F⁺，基因重組頻率比較高。雜交後，育性基因沒有轉移。

 

2.2.2、中斷雜交法定位大腸杆菌的基因

在Hfr×F^-過程中，人為的中斷大腸杆菌雜交而進行的基因定位叫中斷雜交法。

    （1）中斷雜交的原理

Hfr和F^-一混合，形成接合管，然後進行轉移，越接近原點的基因，進入受體就越快。用振蕩器振蕩使之中斷，檢測受體細胞中的供體基因。1分鍾內出現了受體A基因，則說明A基因很近原點；2分鍾內出現了受體AB基因，則說明B在A之後，也近原點；3分鍾內出現了受體ABC基因，則說明C在AB之後，也近原點；則按時間來定位，標出不同基因位於原點的先後位置，單位：時間單位。據基因進入受體的時間來定位基因（假定轉移是勻速的）。

 

方法： 

 

 

 

 

將 Hfr與F^-同時加入裝有完全培養基的大試管中，一定時間取樣振蕩，洗滌完全培養基，加至添加str的基本培養基（葡萄糖和無機鹽）上，隻能使雜交後代生長，再把菌落分別轉移到隻添加azi、T₁、gal或str的選擇性培養基上。 

 

箭頭表示基因位點位置先後

大腸杆菌隻要有葡萄糖（G）則不利用其它糖類，因此基本培養基中lac⁺ 、lac^-都能生長。選擇培養基中gal或lac隻用其做碳源，沒有其它糖（碳源）。

 

一個菌株隻能測少數（如6個）基因，接合管便斷裂。