噬菌體的分離和鑒定

 

部分菌株對應的噬菌體分離過程步驟：

 

(1) 以新鮮鴿糞4g 加入100ml 普通液體培養基內，放入37 ℃溫箱培養24h。

(2) 次日從中取出10ml70 ℃加熱30min ,離心2000r/ 10min ,上清液用濾器過濾後保存於4 ℃冰箱備用。

(3) 在普通瓊脂平板底麵分別注明1、2、3 號。

(4)在1 號平板接種事先培養好的6h 幼齡菌乙型副傷寒杆菌一接種環；2 號平板接種幼齡菌福氏痢疾杆菌一接種環;3 號平板接種幼齡菌大腸杆菌一接種環,各平板的細菌密集塗布於瓊脂平板表麵。

(5) 再用無菌接種環取鴿糞培養濾液一接種環,分別滴加於3 個已接種細菌的平板中央,放入37 ℃溫箱孵育24h。

 

先後從農貿市場采集各類海產品158 份, 分別用15 株假單胞菌作指示菌, 共分離到27 株噬菌體, 分離率為17.11%。檢出的噬菌體經實驗室反複增殖、裂解等鑒定試驗, 從中精選出9 株裂解力較強, 生物學性狀較典型的噬菌體, 分別用雙層瓊脂法作單斑純化培養。這9 株噬菌體的噬菌斑圓形透明, 邊緣有的整齊有的稍不整齊, 直徑均在110～210 mm; 在電鏡下的形態可見有頭部和尾部, 均呈蝌蚪狀; 增殖液的效價均可達10829pfu/m l。

 

在有指示菌的雙層瓊脂平板上逐格滴加備用的待檢噬菌體液,進行交叉裂解試驗,即每一株菌均被所有待檢噬菌體液逐一滴加。待平皿幹後,置37 ℃培養過夜。若有相應的噬菌體存在,即可在平皿上出現裂解噬斑(即為陽性) ,不裂解者為陰性。對分離到的每一噬菌體均經單噬斑分離純化3 次以上,增殖後置4 ℃冰箱保存。

 

4.1 　材料與方法

4.2 　菌株

噬菌體分離所用的指示菌為河流弧菌29301 , 用於宿主範圍測定的菌株共8 株: 河流弧菌Ⅱ9302 , 9401 , 9402 , 9403 , 9404 , 9501 , 9502 及9503 均為本實驗室保存。

4.3 　培養基

培養河流弧菌及噬菌體分離所用的培養基為海水胰蛋白腖培養基。其中: 胰蛋白腖10g , 酵母膏5g , 陳海水1000mL , pH712～715 。製作底層培養基時, 加瓊脂15g ; 製作上層培養基時, 加瓊脂7g。

4.4 　樣品的采集和噬菌體的分離

 

1996、1997 年兩個夏季, 從大連市水產養殖公司所屬皺紋盤鮑養殖區的不同地點采集海水和海底淤積物, 每次采集10 個樣品, 每個樣品為同一地點采集的3 份不同水樣或海底淤積物混合而成。為了分離噬菌體, 取海底淤積物100g , 加入等量海水, 充分振蕩30min , 靜置, 過濾, 取上清液100mL 加入50mL 3 倍濃縮的海水胰蛋白腖及2mL 濃度為1012個/ mL 的河流弧菌2 菌懸液, 30 ℃培養過夜, 以促進噬菌體的增殖。海水樣品過濾後按上述方法直接富集。經富集後的培養液加入1/ 10 的氯仿, 30 ℃靜止1h , 於4000r/ min 離心20min , 取上清液用於雙層瓊脂法分離噬菌體。為了純化噬菌體, 挑取單斑連續傳代, 重複進行5 次以上, 選擇平板上所有噬菌斑形態和大小基本一致的材料,進行下一步研究。