菌種的退化與複壯

1.菌種的退化現象 

隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉接傳代，菌種本身所具有的優良的遺傳性狀可能得到延續，也可能發生變異。變異有正變（自發突變）和負變兩種，其中負變即菌株生產性狀的劣化或有些遺傳標記的丟失均稱為菌種的退化。但是在生產實踐中，必須將由於培養條件的改變導致菌種形態和生理上的變異與菌種退化區別開來。因為優良菌株的生產性能是和發酵工藝條件緊密相關的。如果培養條件發生變化，如培養基中缺乏某些元素，會導致產孢子數量減少，也會引起孢子顏色的改變；溫度、pH值的變化也會使發酵產量發生波動等。所有這些，隻要條件恢複正常，菌種原有性能就能恢複正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。常見的菌種退化現象中，最易覺察到的是菌落形態、細胞形態和生理等多方麵的改變，如菌落顏色的改變，畸形細胞的出現等；菌株生長變得緩慢，產孢子越來越少直至產孢子能力喪失，例如放線菌、黴菌在斜麵上多次傳代後產生“光禿”現象等，從而造成生產上用孢子接種的困難；還有菌種的代謝活動，代謝產物的生產能力或其對寄主的寄生能力明顯下降，例如黑曲黴糖化能力的下降，抗菌素發酵單位的減少，枯草杆菌產澱粉酶能力的衰退等。所有這些都對發酵生產均不利。因此，為了使菌種的優良性狀持久延續下去，必須做好菌種的複壯工作。即在各菌種的優良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。 

 

2. 菌種退化的原因 

菌種退化的主要原因是有關基因的負突變。當控製產量的基因發生負突變，就會引起產量下降；當控製孢子生成的基因發生負突變，則使菌種產孢子性能下降。一般而言，菌種的退化是一個從量變到質變的逐步演變過程。開始時，在群體中隻有個別細胞發生負突變，這時如不及時發現並采用有效措施而一味移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，最後占優勢，從而使整個群體表現出嚴重的退化現象。因此，突變在數量上的表現依賴於傳代，即菌株處於一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數量上逐漸占優勢，於是退化性狀的表現就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。同時，對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發生生產性能的突變不是很容易的，但就一個經常處於旺盛生長狀態的細胞而言，發生突變的機率比處於休眠狀態的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關係密切，應設法控製細胞保藏的環境，使細胞處於休眠狀態，從而減少菌種的退化。 

 

3. 防止退化的措施 

合理的育種 選育菌種時所處理的細胞應使用單核的，避免使用多核細胞； 

合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少分離回複；在誘變處理後進行充分的後培養及分離純化，以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。 

選用合適的培養基 有人發現用老苜蓿根汁培養基培養“5406”抗生菌—細黃鏈黴菌可以防止它的退化。在赤黴菌產生菌—藤倉赤黴的培養基中，加入糖蜜、天門冬素、穀氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質時，也有防止菌種退化的效果。也有選取營養相對貧乏的培養基做菌種保藏培養基，如培養基中適當限製容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過菌株的生長繁殖而產生的，當培養基營養豐富時，菌株會處於旺盛的生長狀態，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化幾率。 

創造良好的培養條件 在生產實踐中，創造和發現一個適合原種生長的條件可以防止菌種退化，如低溫、幹燥、缺氧等。在棲土曲黴3．942 的培養中，有人曾用改變培養溫度的措施(從20-30℃提高到33-34℃)來防止它產孢子能力的退化。 

控製傳代次數 由於微生物存在著自發突變，而突變都是在繁殖過程中發生而表現出來的。所以應盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發突發的機率。菌種傳代次數越多，產生突變的幾率就越高，因而菌種發生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產實踐上，必須嚴格控製菌種的移種傳代次數，並根據菌種保藏方法的不同，確立恰當的移種傳代的時間間隔。如同時采用斜麵保藏和其它的保藏方式（真空凍幹保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。 

利用不同類型的細胞進行移種傳代 在有些微生物中，如放線菌和黴菌，由於其菌的細胞常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現象發生。有人在實踐中發現構巢曲黴如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜麵移種，由於避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。 

采用有效的菌種保藏方法 用於工業生產的一些微生物菌種，其主要性狀都屬於數量性狀，而這類性狀恰是最容易退化的。因此，有必要研究和製定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。 

 

4. 退化菌種的複壯 

退化菌種的複壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現，其中一種是從退化菌種的群體中找出少數尚未退化的個體，以達到恢複菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產性能尚未退化前就經常而有意識地進行純種分離和生產性能的測定工作，以達到菌種的生產性能逐步有所提高。所以這實際上是一種利用自發突變不斷從生產中進行選種的工作。具體的菌種的複壯措施如下： 

純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或塗布法均可。把仍保持原有典型優良性狀的單細胞分離出來，經擴大培養恢複原菌株的典型優良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經培養恢複原菌株性狀。 

 

通過寄主進行複壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應寄主體內以提高菌株的活力。 

聯合複壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯合處理進行複壯。