目的:學習利用細菌檢測基因突變的方法
Ames試驗 即鼠傷寒沙門氏菌營養缺陷型回複突變試驗,是目前檢測基因突變最常用方法之一。
原理:利用鼠傷寒沙門氏菌突變株,即組氨酸缺陷型,其原始菌株菌體內的組氨酸是通過自身一係列酶催化反應合成的,這種能自身合成所需營養成份的菌株叫做野生型菌株。本試驗用鼠傷寒沙門氏菌為突變株,其不能合成組氨酸,而必須由外界提供這種菌珠被稱為營養缺陷式營養實變型(his-)。當誘變劑作用於菌株後,在菌株遺傳物質的特定位點發生基因回複突變成為野生型(his+),故在缺乏組氨酸的培養基上,隻存少數自發回變菌落生長,而能誘發細菌回變的致突變物可使細菌生長增多,從而可判斷被藥物是否具有致實變性。
材料:菌株,鼠傷寒沙門氏菌TA97,TA98,TA100,TA102。
器材:恒溫培養箱,幹燥箱,高壓消毒鍋,水溶鍋,紫外線燈(15w),藥物天平,分析天平 酒精燈,濾紙片,平皿,試管,燒杯,吸管。
培養基配製
1.Vogel-Bonner液10×(VB液10倍濃縮)用於配製底層基本培養基。配製方法:硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1g,檸檬酸(C6H8O7·H2O)10g,磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)65.5g,磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O)17.5g。將上述成分依次用蒸餾水溶解、混勻,然後加蒸餾水至500ml,置4℃冰箱保存。
2.底層基本培養基 取VB液(10倍)100ml,加入蒸餾水800ml,用1mol/L NaOH調pH至7.0,然後加入瓊脂12—15g,經121℃20分鍾高壓滅菌。待冷至800C左右時,加入100ml已經112℃20分鍾高壓滅菌的20%葡萄糖液,混勻後澆製平板。
3.上層培養基 D-生物素12.4mg,L-鹽酸組氨酸9.5mg,NaCl5g,瓊脂6g,上述成分依次加熱溶解,混合,然後加蒸餾水至1000ml。分裝後經121℃15分鍾高壓滅菌備用。
方法
1.藥物的劑量選擇
對於易溶解的藥物,實驗最高劑量可采用抑菌濃度下的最大劑量,或以最大溶解度為最高劑量和5mg/皿為最高劑量,下設5個劑量,(即5000,500,50,5,0.5,0.1μg/皿)。溶劑:藥物是水溶性,可用滅菌蒸餾水,如非水溶性可選二甲亞碸為溶劑。
2.平板摻入法
每皿加底層培養20~25ml,待凝固。取融化並保溫於45℃的上層培養基,分裝於5ml試管中,每支試管2ml,依次加入新鮮菌液0.1ml, 藥物0.1ml,需加S9時則加入S9混合液0.3ml,混勻,迅速倒在底層培養基上,使之分布均勻。待上層瓊脂凝固後,翻轉平板置37℃培養48小時後,觀察結果。
結果評價
觀察結果時,首先應觀察各實驗組和陰性對照的背景菌苔的生長情況。在肯定背景菌苔與陰性對照相差不多後,再比較各劑量組的回變菌落數。若回變菌落數的出現有劑量反應關係,回變菌落數大於自發對照的2倍或以上,結果並具有重現性,並有統計學意義的增加,可判斷為陽性,反之為陰性。
附錄:Ames 試驗記錄表,實驗者可視需要對表加快修改對所用菌株進行鑒定
1.組氨酸營養缺陷(his-)鑒定。取兩塊底層葡萄糖瓊脂平板,其中一塊加入0.1mol/L L 一組氨酸0.1mol和0.5mmol/L生物素0.1ml,另一塊(對照)隻加入生物素。用白金耳先在生物素對照平板上劃線,然後再在組氨酸/生物素平板上劃線,四種菌株可劃在同一平板上。在培養皿底部用標記筆注明每一菌株劃痕。翻轉平板,37℃培養24~48小時,觀察細菌生長情況。對照平板無細菌生長,含組氨酸平板應有細菌生長。
2.深粗糙突變(rfa)鑒定—結晶紫抑菌試驗 加0.1ml等測菌液於裝有2ml上層培養基(融化後保持在45℃)的試管中,旋搖混勻後傾倒於營養瓊脂平板上,傾斜旋轉平板使之分布均勻。凝固後,將一滅菌濾紙片放在平板上,於紙片中心滴加1mg/ml結晶紫10μl,或先用滅菌濾紙片沾取結晶紫液,再放置平板上。倒置平板,在37℃培養12~24小時如在紙片周圍出現明顯的抑菌帶(約10mm),則表明有rfa突變存在。
3.uvrB鑒定——紫外線敏感試驗 用滅菌拭子拈取測試菌株在營瓊脂平板上做平行劃線。有R因子的菌株(TA97,TA98,TA100等)劃線在另外的平板上。用黑紙遮住無蓋平板的一半,另一半在距離33cm處,用一個15W紫外線燈照射,有R因子菌株照射8秒鍾。在同一平板上,應用時用切除修複功能的菌株(如TA102)作為對照。平板照射後,在37℃培養1~24小時,具有uvrB缺陷的菌株,隻在未經照射的一側平板上生長。
4.R因子(pKM101質粒)鑒定—抗氨苄青黴素試驗 用10μl左右氨苄青黴素(8mg/ml,0.02mol/L NaOH)在營養瓊脂平板上劃線,同時用等測菌液在同一平板上與氨苄青黴素交叉劃線。在同一平板上可鑒定幾種菌株,其中包括一種沒有R因子的對照菌株(如野生型),用以說明氨苄青黴素的效力。在37℃培養12~24小時,無R因子者在兩線交叉處出現抑菌,有R因子者則無抑菌現象。亦可仿照鑒定rfa突變的方法,用浸有氨苄青黴素的濾紙片貼在已接種R因子待測菌株的平板上。若紙片周圍無抑菌圈,則表明對氨苄青黴素有抗性,即R因子存在。
5.pAQ1質粒鑒定——抗四環素試驗 方法類似R因子鑒定,四環素濃度為8mg/ml,0.02mol/L HCl,用量10μl。
6.自發回變鑒定 加0.1ml待測菌液於含有2ml上層培養基的試管中,混勻後鋪倒在底層基本培養基上。37℃培養24小時,計數每皿自發的回變菌落數。 四種標準菌株的回變菌落數(不加S9)
營養肉湯配製(增藥用),氯化鈉0.5g、牛肉膏0.5g、蛋白腖1.0g、雙蒸水100ml,溶解後,用4N NaOH調pH至7.2 ,15磅滅菌20分鍾,備用。
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