包埋法固定化微生物問題初探(1)

摘  要  本文概括介紹並比較了固定化技術的幾種主要的方法，並對目前筆者正在進行的包埋法固定化試驗中的兩個方法——海藻酸鈉包埋法和PVA—H₃BO₃包埋法做了一定的介紹和不同方法的比較。最後，簡要介紹了固定化細胞的性能的評價以及該種技術的應用和前景。

關鍵字 固定化 包埋法 海藻酸鈉  PVA—H₃BO₃  載體

1、引言

固定化微生物技術使用化學或物理手段，將遊離細胞或者酶定位於限定的區域，使其保持活性並可反複利用的方法。最初主要用於發酵生產，70年代後期，被利用到水處理領域，近年來則成為各國學者研究的熱點。固定化微生物技術克服了生物細胞太小，與水溶液分離較難，易造成二次汙染的缺點，保持了效率高、穩定性強、能純化和保持高效菌種的優點，在廢水處理領域有廣闊的應用前景。在實際應用過程中，如何固定、何種載體，才能使固定化微生物能較長時間的保持一定的強度和活度，才能降低固定化成本，延長固定微生物的使用壽命，是該技術在汙水處理中得到廣泛應用的關鍵。

2、常用的固定化方法

廢水處理中常用微生物固定化方法主要有：包埋法、交聯法、載體結合法。

 2.1包埋法

包埋法的原理是將微生物細胞截流在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網絡空間中。通過聚合作用或者離子網絡形成，或通過沉澱作用，或改變溶劑、溫度、pH值使細胞截流。凝膠聚合物的網絡可以阻止細胞的泄漏，同時能讓基質滲入和產物擴散出來。

固定化微生物細胞的實用化對包埋載體的要求包括：

（1）    固定化過程簡單，易於製成各種形狀，能在常溫常壓下固定化；

（2）    成本低；

（3）    固定化過程中及固定化後對微生物無害；

（4）    基質通透性好；

（5）    固定化細胞密度大；

（6）    載體內細胞漏出少，外麵的細胞難以進入；

（7）    物理強度和化學穩定性好；

（8）    抗微生物分解；

（9）    沉降分離性好。

 在這些要求中，（1）和（2）涉及固定化細胞製備的成本；（3）~（6）針對固定化細胞的催化活性；而（7）~（9）則是出於對固定化細胞的操作穩定性的考慮。

2.2交聯法

交聯法是使用雙功能的試劑與酶分子進行分子間的交聯固定化方法。由於酶蛋白的功能團參與此反應，所以酶的活性中心構造可能受到影響，而使酶顯著失活。此外，交聯劑如戊二醛等價格昂貴，限製了其應用。

2.3吸附法

又稱載體結合法，是通過物理吸附、化學或者離子的結合，將微生物固定於非水溶性載體。這種方法操作簡單，對微生物活力影響小，但所結合的微生物數量有限，反應穩定性和反複使用性差。主要分為物理吸附法、共價結合法、離子結合法和生物特異性吸附法四種方法。

2.4三種固定化方法的比較

盡管固定化方法多種多樣，但沒有一種理想的、普遍適用的方法。交聯法突出優點是可以獲得很高的細胞密度，但由於缺乏良好的機械強度而不能得到廣泛的應用。吸附法的固定操作簡單，條件溫和，而且載體可以再生；但是細胞與載體之間的結合力較弱，因此操作的穩定性不好。包埋法有較好的綜合性能，催化活性保留和存活力都比較高，且包埋在反應工程（包括反應器的設計、操作穩定性等）中應用靈活，因此，包埋法成為整個固定化生物催化劑技術中應用最廣泛的固定化方法；但是包埋法的擴散阻力較大，使細胞的催化活性受到限製，且不適用於涉及大分子物質的反應。三種固定化方法總結於下表：

 

表一 三種固定化方法的比較

 

3、包埋法固定化微生物的兩種方法舉例

天然高分子多糖類的海藻酸鈉，具有固定化成形方便，對微生物毒性小以及固定化密度高等優點，但是其抗微生物分解性能較差，機械強度較低，同時海藻酸鈉凝膠再高濃度的磷酸緩衝液的反複衝擊下，經過一段時間，顆粒變軟、粘連。合成高分子化合物中常用的載體材料是聚乙烯醇（polyvinyl alcohol 簡稱PVA），其突出優點是抗微生物分解性能好，機械強度高，化學穩定性能好。但是聚合物網絡的形成條件比較劇烈，對微生物細胞的損害較大，而且成形的多樣性和可控性不好。下麵將對這兩種包埋方法作一個簡單的介紹：

3.1海藻酸鈣包埋法

3.1.1原理

    海藻酸鈣包埋法是一種使用最廣、研究最多的包埋固定化方法，它具有固化、成形方便，對微生物毒性小，固定化細胞密度高等優點。

海藻酸是用於包埋固定化微生物的第一個聚合物，但是當存在高濃度的K⁺、Mg²⁺、磷酸鹽以及其他單價金屬離子時，海藻酸鈣凝交的結構會受到破壞。此外，由於海藻酸鈣凝膠網絡的孔隙尺寸太大，酶可能會從網絡中泄露出來，因此不適合大多數酶的固定化。

海藻酸鹽是棕色藻類的胞內產物，它由兩種不同類型的單糖組成，即1，4—β—D—甘露糖醛酸（M）和1，4—α—L—古洛糖醛酸（G）。海藻酸鹽是一種聚合物。

海藻酸鹽不能形成熱可逆性凝膠。通常是在其鈉鹽溶液中加入二價離子，如Ca²⁺，通過Ca²⁺取代Na⁺來形成凝膠網絡。凝膠的性質與引入的二價陽離子及海藻酸鈉的類型（主要是兩種單糖的組成比例）有關。

二價陽離子對凝膠的機械強度有較大的影響，元素周期表的第二主族金屬離子於海藻酸鈉鹽形成的凝膠，其強度順序如下：

Ba²⁺>Sr²⁺>Ca²⁺>>Mg²⁺

利用海藻酸鈉凝膠固定化微生物法安全、快速、製備簡單，反應條件溫和，成本低廉且適用於大多數微生物的固定化。

3.1.2固定化方法

以海藻酸鹽為載體，建立包埋固定化微生物的方法如下：

方法I

①將海藻酸鈉加熱溶於水；

②將海藻酸鈉溶液與微生物細胞混合均勻，使海藻酸鈉最終濃度為2%~4%；

③將海藻酸鈉與菌體混合液用針形管滴入5%~10%的CaCl₂溶液中，固定化7~8h；

④濾出顆粒，用生理鹽水洗淨，備用。

方法 II

①將按方法I製得的固定化細胞顆粒置於0.06mol/L的己二胺溶液中攪拌1~2h；

②濾出顆粒，水洗後，用0.5%戊二醛交聯5min；

③濾出顆粒，用生理鹽水洗淨，備用。

方法III

①將按方法I製備的固定化顆粒浸泡於下列溶液中：

  殼聚糖 0.5%   CaCl₂ 0.2mol/L  pH 6.0

②濾出顆粒，水洗後，用0.5%戊二醛交聯5min；

③濾出顆粒，用生理鹽水洗淨，備用。

 分別利用以上三種固定化方法，包埋黑曲酶細胞，比較各種固定化細胞的活性，其結果如表二：

 

                      表二 海藻酸鈣包埋法的比較

固定化方法	方法I	方法II	方法III
固定化細胞相對活性	57.1%	52.9%	44.8%

 

由表二可以看出，用海藻酸鈉係列包埋固定化方法固定化微生物，固定化細胞的活性較高。其中用方法I固定化細胞的活性最高，在方法II、III中，由於在海藻酸鈣凝膠表層突上了一層高分子膜，雖然增強了固定化顆粒的機械強度，但是同時加大了底物及氧的擴散阻力，從而降低了細胞活性。此外，在方法II、III中所采用的戊二醛對細胞液具有毒性，在使用前應作毒性試驗，確定是否采用改種交聯劑。

3.1.3海藻酸鈉包埋法固定化試劑對細胞活性的影響

（1）海藻酸鈉對細胞活性的影響

    海藻酸鈉是一類天然高分子多糖類，對微生物沒有毒害作用。但海藻酸鈉的濃度會影響固定化細胞的機械強度、質量傳遞等，進而影響到微生物的活性。

海藻酸鈉濃度對固定化細胞活性的影響如表三所示。

 

表三 海藻酸鈉濃度對細胞活性的影響