需氧性細菌分離培養法

需氧性細菌分離培養法

1. 平板劃線分離法

菌種被其他雜菌汙染時或混合菌懸液常用平板劃線法進行純種分離，此法是借助將蘸有混合菌懸液的接種環在平板表麵多方向連續劃線，使混雜的微生物細胞在平板表麵分散，經培養得到分散的由單個微生物細胞繁殖而成的菌落，從而達到純化目的。 但劃線分離的培養基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍幹後才可使用；為便於劃線，一般培養基不宜太薄，每皿約傾倒20 ml培養基，培養基應厚薄均勻，平板表麵光滑。劃線分離主要有連續劃線法（圖4-1）和分區劃線法（圖4-2）兩種。劃線法示意圖見圖4-3。

（1）連續劃線法

以無菌操作用接種環直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點種在平板邊緣一處，取出接種環，燒去多餘菌體。將接種環再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環冷卻，然後從接種細菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線，劃線時平板麵與接種環麵成30～40度角，以手腕力量在平板表麵輕巧滑動劃線，接種環不要嵌入培養基內劃破培養基，線條要平行密集，充分利用平板表麵積，注意勿使前後兩條線重疊。劃線完畢，關上皿蓋。灼燒接種環，待冷卻後放置接種架上。培 養皿倒置於適宜的恒溫箱內培養。培養後在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態，塗片鏡檢為純種後再接種斜麵。

(2)分區劃線法（四分區劃線法）

取菌、接種、培養方法與“連續劃線法”相似。分區劃線法劃線分離時平板分4個區，故又稱四分區劃線法。其中第4區是單菌落的主要分布區，故其劃線麵積應最大。為防止第4區內劃線與1、2、3區線條相接觸，應使4區線條與1區線條相平行，這樣區與區間線條夾角最好保持120度左右。先將接種環蘸取少量菌在平板上1區劃3-5條平行線，取出接種環，左手關上皿蓋，將平板轉動60～70度。灼燒接種環，待在平板邊緣上冷卻後，再按以上方法以1區劃線的菌體為菌源，由1區向2區作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時再把平皿轉動約60～70度，同樣依次在3、4區劃線。劃線完畢，灼燒接種環，關上皿蓋，倒置於37℃恒溫箱中培養24h後，在劃線區觀察單菌落。

2. 傾注平皿分離法

被檢材料若含有兩種或兩種以上細菌時,可借助溶化的瓊脂將細菌稀釋，待瓊脂冷凝後,分散的細菌就被固定在原地形成菌落.這樣也能達到分得純種的目的。根據材料中存在菌數的多少，傾注平皿前可將被檢材料不稀釋或用生理鹽水作適當稀釋。其具體方法如下：

取三支預先準備的普通瓊脂培養基試管，水浴加熱融化，冷至約50℃，用火焰滅菌接種環釣取待分離物接種至第一管內，充分搖勻後，自第一管取一接種環內容物至第二管，以同樣方法自第二管移種至第三管。然後分別傾注一個已滅菌的平皿，凝固後倒轉置於37℃溫箱內培養24h。結果多數細菌在瓊脂內生長成菌落，僅少數菌落出現在表麵，通常第一個平板內的菌落數較多而密集，第二、三個平板則逐漸減少，可見單個菌落。

3. 芽胞需氧菌分離培養法

如果被檢材料中可疑有帶芽孢的細菌，可先將被檢材料加少量生理鹽水或肉湯，置於80℃水浴箱中維持15～20分鍾，或85℃加熱10分鍾，再進行培養。材料中若有帶芽孢的細菌仍可存活而生長繁殖，不耐熱的細菌繁殖體則被殺滅。

4．利用化學藥品的分離培養法

（1）抑菌作用  有些藥品對某些細菌有極強的抑製作用，而對另外一些細菌沒有抑製作用，所以可利用這種特性進行細菌的分離，例如通常在培養基中加入結晶紫或青黴素等化學藥品來抑製革蘭氏陽性菌的生長，以分離得到革蘭氏陰性菌。

（2）殺菌作用  將病料如結核病料用15％硫酸溶液處理，其他雜菌均被殺死，而結核杆菌因具有抗酸性而存活。

（3）鑒別作用  利用細菌對某種糖的分解能力，通過培養基中指示劑的變化來鑒別某種細菌。例如遠藤氏培養基可以用來鑒別大腸杆菌與沙門氏杆菌。

5. 實驗動物分離法

被檢病料中疑有某種病原菌存在，可將病料以無菌操作取出，放入滅菌乳缽或組織勻漿器內，加3～5倍量無菌生理鹽水製成混懸液，吸取一定量混懸液注射（肌肉、腹腔、皮下或靜脈）入易感實驗動物,待實驗動物死後，取其髒器，常可分離到純的病原菌。例如，疑有豬丹毒杆菌存在的病料，可注射於鴿體，鴿死後，再取其脾髒以分離豬丹毒杆菌，可得到純培養。

6. 瓊脂斜麵分離法

取瓊脂斜麵3管，用接種環蘸取欲檢病料少許（如為髒器，先將表麵燒烙後，用滅菌解剖刀切開，以滅菌接種環由切口插入、轉動、釣取組織），混合於第1管的凝集水中，再作斜麵劃線；然後抽出接種環，不經燒灼，繼續在第2管、第3管斜麵上作同樣劃線。劃畢，置37℃溫箱中培養。經此法分離培養後，第2管的菌落較第1管為少，第3管的菌落更少，如此較易得到單個菌落，達到純培養之目的。

7. 瓊脂平板塗布分離法

被檢病料如血液、腹水等，可用滅菌毛細吸管或吸管吸取 1～2滴置於平板中央，用滅菌的L形玻棒作均勻塗布。如估計細菌數很多，可直接用火焰滅菌的接種環釣菌，並做分區劃線。如為髒器病料，可先作成乳懸液再行塗布；或取其一小塊，用鑷子夾住，表麵燒烙後，用滅菌刀切開，以其切麵直接進行塗布，此法適用於含菌量較少的病料的分離。

8. 營養肉湯分離法

當組織病料中含病原菌少，或有抗菌藥殘留時，用上述瓊脂斜麵或平板分離法可能無菌落長出，這時可以無菌操作剪取一小塊病料直接投入肉湯，經37℃培養，在肉湯中長出細菌後，再用瓊脂斜麵或瓊脂平板分離。

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