厭氧性細菌分離培養法

細菌接種後，直接放在恒溫箱內培養，可以使需氧菌與兼性厭氧菌生長繁殖；但對厭氧菌，則需將培養環境或培養基中的氧氣除去，或將氧化型物質還原，降低其氧化還原電勢，才能生長繁殖。在有氧的環境下，培養基的氧化還原電勢較高，不適於厭氧菌的生長。為使培養基降低電勢，降低培養環境的氧分壓是十分必要的。現有的厭氧培養法很多，主要有生物學法、化學法和物理學法，可根據各實驗室的具體情況而選用。

（一）生物學方法

培養基中含有植物組織（馬鈴薯、燕麥、發芽穀物等）或動物組織（新鮮動物組織小片，或加熱的肌肉、心腦等），因組織的呼吸作用，以及組織中可氧化物質的氧化而消耗氧氣（肌肉、腦磷脂中不飽和脂肪酸的氧化，碎肉培養基的應用），造成厭氧環境，以利於厭氧性細菌的生長繁殖。同時，組織中所含的還原性化合物（穀胱甘肽）也可使氧化-還原電勢下降。

此外，將厭氧菌與需氧菌共同培養在同一環境中，則環境中的氧被需氧菌消耗，造成厭氧環境，也有利於厭氧菌的生長繁殖。

1. 動物組織及其他物質加入法  在液體培養基內加入肝髒、腎髒等動物髒器，因其中的半胱氨酸的一SH基極不穩定，為強還原劑，所以可利用此培養基進行厭氧培養，在培養之前將肝片肉湯加熱，以驅出空氣，冷卻，然後接種培養。

2. 共棲培養法  將厭氧菌與需氧菌共同培養在同一個平皿內，利用需氧菌的生長繁殖將氧氣消耗後，造成厭氧環境利於厭氧菌生長。其具體方法是將培養皿的一半接種消耗氧氣能力極強的需氧菌如靈杆菌、大腸杆菌、枯草杆菌等。另一半接種厭氧菌， 接種後將平皿倒扣在一塊玻璃板上，並用石蠟密封，置37℃恒溫箱中培養2～3d， 即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先後生長。

（二）化學方法

利用還原能力強的化學物質，將環境或培養基內的氧氣消耗，或還原氧化型物質，降低氧化-還原電勢。

1. 焦性沒食子酸法  焦性沒食子酸在堿性溶液內能大量地吸收氧而造成厭氧環境，有利於厭氧菌的生長繁殖。通常100cm³空間用焦性沒食子酸1g及10％氫氧化鈉或氫氧化鉀10m1。具體方法有下列幾種：

（1）平板培養法  將厭氧菌劃線接種於適宜的瓊脂平板，取一小團直徑約2cm的脫脂棉，置於平皿蓋的內麵中央，其上滴加0.5ml 10％氫氧化鈉溶液；在靠近脫脂棉的一側放置0.5g焦性沒食子酸，暫勿使兩者接觸。立即將已接種的平板覆蓋於平皿蓋上，迅速用融化的石蠟密封平皿四周。封畢，輕輕搖動平皿，使被氫氧化鈉溶液浸濕的脫脂棉與焦性沒食子酸接觸，然後置37℃恒溫箱中培養24～48h後，取出觀察。

（2）Buchner氏試管法（圖4-4）  取一大試管，在管底放焦性沒食子酸0.5g及玻璃珠數個或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養管放入大試管中，迅速加入2％NaOH溶液0.5ml，立即將試管口用橡皮塞塞緊，必要時周圍用石蠟密封。37℃培養24～48h後觀察。

（3）瑞氏厭氧培養法（圖4-5）  將已接種細菌的培養管的脫脂棉棉塞在火焰中灼燒滅菌後，塞入管中離培養基1～1.5cm處，置適量焦性沒食子酸於其上，加入10%NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥或石蠟嚴密封閉置溫箱中培養。

（4）史氏厭氧培養法  用圖4-6所示的厭氧培養皿，在皿底一邊置焦性沒食子酸，另一邊置NaOH溶液，將已接種的平皿翻蓋於皿上，並將接合處用膠泥或石蠟密封，然後搖動底部，使氫氧化鈉與焦性沒食子酸混合，置溫箱中培養。

（5）平皿厭氧培養法  置一片中有小圓孔的金屬板於兩平皿之間，上麵的平皿接種細菌，下麵的平皿盛焦性沒食子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封閉後置溫箱中培養（圖4-7）

（6）玻罐或幹燥器法  置適量焦性沒食子酸於一幹燥器或玻罐的隔板下麵，將培養皿或試管置於隔板上，並在玻罐內置美蘭指示劑一管，從罐側加入氫氧化鈉溶液於罐底，將焦性沒食子酸用紙或紗布包好，用線係住，暫勿與氫氧化鈉接觸，等一切準備好後，將線放下，使焦性沒食子酸落入氫氧化鈉溶液中，立即將蓋蓋好，密封，置溫箱中培養。

    2. 李伏夫（B.M.JIbBOB）氏法  此法是利用連二亞硫酸鈉（Sodium hyerosulphite）和碳 酸鈉以吸收空氣中的氧氣,釋放二氧化碳造成厭氧環境。其反應式如下：

Na₂S₂O₄+Na₂CO₃+O₂→Na₂SO₄+Na₂SO₃+CO₂

取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放於罐內（如是液體培養基，則直立於罐內），最上端保留可容納1～2個平皿的空間（視玻罐的體積而定），按玻罐的體積每1000cm³空間用連二亞硫酸鈉及碳酸鈉各30g，在紙上混勻後，盛於上麵的空平皿中，加水少許使混合物潮濕，但不可過濕，以免罐內水分過多。若用無蓋玻罐，可將平皿重疊正放在淺底容器上，以無蓋玻罐置於皿上，罐口周圍用膠泥或水銀封閉,如圖4-8所示。

3. 硫乙醇酸鈉法  硫乙醇酸鈉是一種還原劑，加入培養基中，能除去其中的氧或還原氧化型物質，促使厭氧菌生長。其它可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C及半胱氨酸等。

（1）液體培養基法  將細菌接入含0.1%的硫乙醇酸鈉液體培養基中，並加入美蘭溶液作為氧化還原的指示劑，37℃培養24～48h後觀察，在無氧條件下，美蘭被還原成無色。

（2）固體培養基法  利用特殊構造的Brewer氏培養皿，可使厭氧菌在培養基表麵生長而形成孤立的菌落。具體方法如下：先將Brewer氏培養皿幹熱滅菌，將溶化冷卻至50℃左右的硫乙醇酸鈉固體培養基傾入皿內。待瓊脂冷凝後，將厭氧菌接種於培養基的中央部分。蓋上皿蓋，使皿蓋內緣與培養基外圍部分相互緊密接觸（圖4-9）。此時皿蓋與培養基中央部分留在空隙間的氧氣被硫乙醇酸鈉還原，美蘭指示劑逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，仍呈藍色。將Brewer氏培養皿於37℃恒溫箱內24～48h後觀察。

（三） 物理學方法

利用加熱、密封、抽氣等物理方法，以驅除或隔絕環境及培養基中的氧氣，造成厭氧環境，有利於厭氧菌的生長繁殖。

1. 厭氧罐法  常用的厭氧罐有Brewer氏罐、Brown氏罐和Mc1gtosh－Fildes二氏罐（圖4-10）。將接種好的厭氧菌培養皿依次放於厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣至大氣壓。通電，使罐中殘存的氧與氫經受鉑或鈀的催化而化合成水，使罐內氧氣全部消失。將整個厭氧罐放入溫箱培養。

2. 真空幹燥器法  將接種好的平皿或試管放入真空幹燥器中，開動抽氣機，抽至高度真空後，替代以氫、氮或二氧化碳氣體。將整個幹燥器放進孵育箱中培養。

3. 加熱密封法  將液體培養基放在阿諾氏鍋內加熱10min，驅除溶解液體中的空氣，取出，迅速置於冷水中冷卻。接種厭氧菌後，在培養基液麵覆蓋一層0.5cm的無菌凡士林石蠟。置37℃培養24～48h後觀察。

4. 高層瓊脂柱法  加熱融化一管適合分離厭氧菌用的瓊脂培養基，待冷至50℃左右，接入少許經適當稀釋的待分離的培養物或含菌材料，充分搖震均勻。在瓊脂凝固前，迅速以無菌滴管吸取上述已接種的瓊脂培養基，注入準備好的玻璃管內（長約15 cm，一端塞小膠塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高壓滅菌備用），裝至4／5左右之處，塞好棉花塞，放在大試管或玻璃筒內，置37℃恒溫箱中培養。長出菌落後，拔去膠塞和棉花塞，以無菌玻棒將瓊脂柱推出於無菌平皿中，再用滅菌接種環釣取獨立菌落作厭氧純培養。

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