真菌分離培養應考慮所分離真菌的特性，配製合適的培養基，選擇所需的氣體環境。同時, 由於真菌分離材料常汙染有大量細菌，所以可在培養基中加入抗菌素並在分離培養過程中嚴格執行無菌操作。
目的要求
1．掌握真菌分離培養方法。
2．認識真菌菌落的特征，比較與細菌菌落有何不同。
3．了解真菌載片培養法。
4．掌握觀察真菌的基本方法，並觀察其形態特征。
操作步驟
—、真菌的分離培養方法
（－）平板劃線分離法
1．取適合真菌的瓊脂培養基融化，冷至
2．取要分離的材料（如田土、混雜的或汙染的真菌培養物、真菌）少許，投入盛無菌水的試管內，振搖，使分離菌懸浮於水中。
3．將接種環經火焰滅菌並冷卻後，蘸取上述菌懸浮液，進行平板劃線(同細菌的劃線法)。
4．劃線完畢，置溫箱中培養2～5d，待長出菌落後，釣取可疑單個菌落先作製片檢查，若隻有一種所需要的真菌生長，即可進行釣菌純培養。如有雜菌可從單個菌落中釣少許菌製成懸液，再作劃線分離培養，有時需反複多次，才得純種。另外，也可在放大鏡的觀察下，用無菌鑷子夾取一段待分離的真菌菌絲，直接放在平板上作分離培養，可獲得該種真菌的純培養。
（二）稀釋分離法
1．取盛有無菌水的試管5支（每管9ml），分別標記1、2、3、4、5號。取樣品（如田土等）
2．用1ml滅菌吸管，按無菌操作法，從1號管中吸取1ml懸浮液注入2號管中，並搖勻；同樣由2號管取1ml至3號管，依此類推，直至5號管。注意每稀釋一管應更換一支滅菌吸管。
3．用2支無菌吸管分別由4號、5號試管中各取1ml懸液，並分別注入2個滅菌培養皿中，再加入融化後冷至
二．真菌培養性狀觀察
（一）真菌在固體培養基上的生長表現
1 .酵母菌菌落：酵母菌在固體培養基上多呈油脂狀或蠟脂狀，表麵光滑、濕潤、黏稠，有的表麵呈粉粒狀、粗糙或皺褶。菌落邊緣有整齊、缺損或帶絲狀。菌落顏色有乳白色、黃色或紅色等。
2. 黴菌菌落：將不同黴菌在固體培養基上培養2～5d，可見黴菌菌落呈絨毛狀、絮狀、蜘蛛網狀等。菌落大小依種而異，有的能擴展到整個固體培養基，有的有一定的局限性（直徑1～
（二）真菌在液體培養基中的生長表現
1. 酵母菌 注意觀察其混濁度、沉澱物及表麵生長性狀等。
2. 黴菌 黴菌在液體培養基中生長，一般都在表麵形成菌層，且不同的黴菌有不同的形態和顏色。
三． 真菌的形態觀察
（一）真菌水浸片的製備及觀察
常用美蘭染色液製備真菌水浸片來觀察真菌的菌體形態，並且活細胞能還原美藍為無色，故可區別死細胞、活細胞。
1. 酵母菌水浸片的製備
將美蘭染色液一滴滴加在幹淨的載玻片中央，如不染色則加蒸餾水一滴，用接觸環以無菌操作取培養48h左右的酵母菌體少許，在液滴中輕輕塗抹均勻（液體培養物可直接取一接種環培養液於玻片上）並加蓋幹淨蓋玻片。為避免產生氣泡，應先將其一邊接觸液滴，再慢慢放下蓋片。然後置於顯微鏡載物台上進行觀察，注意酵母菌的形態、大小和芽體，同時可以根據是否染上顏色來區別死、活細胞。
2. 黴菌水浸片的製備
在幹淨載玻片上加蒸餾水或美蘭染色液一滴。取培養2～5d的根黴或毛黴、培養3～5d的曲黴、青黴或木黴、培養2d左右的白地黴同上法製片。黴菌要選擇有無性孢子的菌體，用解剖針挑取少量菌絲體放在載玻片的液滴中，將玻片置於解剖鏡下，細心地用解剖針將菌絲體分散成自然狀態，然後加蓋玻片，注意不要讓其產生氣泡，蓋後不再移動玻片，以免弄亂菌絲。製好片後，就可以在顯微鏡下觀察。
觀察時注意它們的菌絲有無隔膜、孢子囊柄與分生孢子柄的形狀、分生孢子小梗的著生方式、孢子囊的形態、足細胞與假根的有無、孢子囊孢子和分生孢子的形狀和顏色、節孢子的形狀和特點等。並且要區別根黴與毛黴、青黴、曲黴、木黴之間的異同點以及白地黴的特點。
（二）黴菌封閉標本的製備
黴菌的封閉標本，常用乳酸石炭酸液封片，其中含有的甘油使標本不宜幹燥，而石炭酸又有防腐作用。在封片液中，還可加入棉藍或其它酸性染料，以便於觀察菌體。
在潔淨載玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，用解剖針從黴菌菌落的邊緣處取少許帶有孢子的菌絲於染液中，再細心地把菌絲挑成自然狀態，然後用蓋玻片蓋上，注意不要產生氣泡。在溫暖幹燥室內放數日，讓水分蒸發一部分，使蓋玻片與載玻片緊貼，即可封片。封片時，先用清潔的紗布或脫脂棉將蓋玻片四周擦淨，並在蓋玻片周圍塗一圈加拿大樹膠或合成樹膠，風幹後即成封閉標本。
（三）真菌的載片培養
取直徑
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