PCR方法檢測病原微生物
錄入時間:2011-8-11 15:19:12
來源：生物在線
多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)是一種模擬天然DNA複製過程，在體外擴增特異性DNA（或RNA）片段的新技術。本實驗是將待檢雙鏈DNA經94℃高溫變性成單鏈作模板，然後加入一對人工合成的寡核苷酸引物，引物分別與待擴增DNA片段的兩端互補，經55℃低溫退火，引物與模板互補結合。在72℃條件下，結合於模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反應體係中的4種dNTP為原料，按堿基互補配對的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。經過20-30個周期後，特異的目的DNA可擴增百萬倍以上。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳後即可觀察到特異的擴增條帶。
PCR方法操作簡便，靈敏度高，可檢測出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應用於多種病原微生物及寄生蟲的檢測。
【材料】
1．無菌雙蒸水、石蠟油、溴化乙錠
2．10×PCR反應緩衝液
3．25mmol dNTP混合液
4．引物1，引物2各50pmol／u1
5．模板DNA
6．5U／ul Taq DNA聚合酶
【儀器】
1．PCR擴增儀
2．電泳儀
3．紫外線分析儀
【方法】
1．在0.5m1EP管中，加入以下成分：
10×PCR反應緩衝液 5u1
引物1 2ul
引物1 2ul
模板DNA 10u1
dNTP混合液 4ul
Taq DNA聚合酶 1ul
無菌雙蒸水 加至 50ul
混勻, 加50 ul石蠟油，防止樣品水分蒸發。
2．將反應管置於PCR儀中，94℃變性4min。然後按94℃變性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循環35次後，72℃延伸10 min。
3．反應完成後，取l0ul PCR擴增液，加至2％瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓100V，電泳30~60min後，置紫外線分析儀下觀查擴增結果。
上一篇：細胞學技術的一般環節
下一篇：阿維菌素試驗方案
