一、實驗原理
Lederberg和Tatum（1946）選用典型的大腸杆菌為材料，篩選營養缺陷型。利用雙重和三重缺陷型的菌株，在簡單的合成培養基上混合培養，在此培養基上隻有重組子能長，親本不能長，即所謂選擇性培養，使細菌雜交獲得成功。圖12-1說明了細菌的基因重組是不同基因型的細菌經接觸，接合後隨之發生交換和雜種細菌分離的過程。
大腸杆菌的雜交試驗中發現有些菌株經混合培養能得到重組子，有些卻不能。1952年Hayes做了一個實驗，他所用的二個菌株是菌株A和菌株B。菌株A是不能合成甲硫氨酸和生物素；菌株B是蘇氨酸、亮氨酸和維生素B1的三重缺陷型。Hayes首先篩選鏈黴素抗性突變型ASr和BSr，然後在不含鏈黴素的基本培養基上進行正反雜交，結果沒有不同，但在含鏈黴素的基本培養基上進行正反雜交，結果卻不一樣，在ASs×BSr雜交中能得到重組子，可是ASr×BSs雜交中卻並不出現重組菌落。這一現象說明大腸杆菌中有不同的“性”，它與致育因子F有關。同時按細胞中有無F因子將大腸杆菌分為二類，有F因子的為F+，沒有F因子為F-。F因子是一個小的DNA環狀分子，分子量約4.5×106道爾頓。帶有F因子的細胞，表麵有一種稱為性菌毛的毛狀突起，長約1至20μ。性菌毛上有雄性專一噬菌體（MS2、k17、f2、Qβ等）的吸附位點，又和細胞的接合有關。F因子在細胞中能以二種狀態存在；遊離狀態和整合到寄主染色體的一定位置。以致帶有F因子的大腸杆菌可分為二類：F+和Hfr菌株。經吖啶橙處理F+變為F-，而Hfr性質不變，說明F因子在F+菌株中呈遊離狀態，而在Hfr菌株中則整合到寄主染色體的一定位置（圖12-2）。
大腸杆菌雜交在F+與F-菌株之間進行，通過細胞的暫時溝通，形成局部合子。在部分合子的形成中，提供部分染色體或少數基因的菌稱為供體菌，提供整個染色體的菌稱為受體菌；所以F+和Hfr是供體細菌，F-是受體菌。F+和F-能雜交，Hfr和F-也能雜交，F-和F-則不能雜交；但這二個可雜交組合其特性不同，主要表現在：1.Hfr細菌和F-細菌雜交以後F-細菌性質不變，F+和F-細菌雜交以後F-細菌轉變為F+（約70％）。2.F+和F-細菌雜交重組頻率10-6，Hfr和F-細菌雜交重組頻率高出F+菌株幾百倍，稱高頻重組。
在F+與F-雜交中，F因子由F+供體高頻轉移到F-受體，低頻轉移宿主染色體的標誌。原因是F+群體中每個細胞能轉移性因子到F-受體，隻有小部分細胞能轉移染色體的標記。在Hfr與F-雜交中，Hfr供體的染色體由原點（在F因子內）開始轉移進入受體菌，在這過程中F因子被割裂，F因子基因，一些是首先進入，另一些是最後進入。在這類雜交中隻有當交配過程長到足以允許整個供體染色體被轉移入F-受體，受體細胞才能由F-變為Hfr。
雜交實驗有多種不同方法，這裏介紹的是直接混合培養和液體培養。直接混合培養法操作簡單，適用於確定二個菌株間能否雜交或測定重組頻率的高低，而液體培養適宜於細菌的基因定位。
二、實驗材料
大腸杆菌（EscherichiacoliK12）的四個菌株：K12Pro（λ）F+；W1485HisIleF+；W1177ThrLeuthixylGalaramtl mallacstrr（λ）F-；HfrCMetTrp。
Pro：脯氨酸，（λ）：原噬菌體整合在染色體上，His：組氨酸，ilv：異亮氨酸纈氨酸，Thr：蘇氨酸，Leu：亮氨酸，thi：維生素B1，xyl：木糖，Gal：半乳糖，ara：阿拉伯糖，mtl：甘露醇，mal：麥芽糖，lac：乳糖，strr：鏈黴素抗性，Met：甲硫氨酸，Trp：色氨酸。
三、實驗器具和藥品
1.用具：滅菌培養皿（9厘米），滅菌三角瓶（150毫升），滅菌吸管（1、5、10毫升），滅菌離心管，滅菌空試管。
2.培養基：
（1）基本培養基Vogel50×*：MgSO4·7H2O10克，檸檬酸100克，NaNH4HPO4·4H2O175克，K2HPO4500克（K2HPO4·3H2O644克），蒸餾水約1，000毫升**（配好後放入冰箱保存備用）。
（2）平板用基本培養基：Vogel50×2毫升，葡萄糖2克，瓊脂2克***，蒸餾水98毫升，pH7.0，高壓滅菌8磅/英寸230分鍾。
（3）液體完全培養基（肉湯培養基）：牛肉膏0.5克，蛋白腖1克，NaCl0.5克，蒸餾水100毫升，pH7.2，高壓滅菌15磅/英寸215分鍾。
（4）半固體培養基：瓊脂0.7—1克，蒸餾水100毫升，pH7.0，高壓滅菌15磅/英寸215分鍾。
四、實驗說明
大腸杆菌中除了不同型細胞的接合外，同型細胞F+與F+或*即濃度為使用濃度的50倍。
**將稱好的藥品分別溶解於670毫升蒸餾水中，待一種藥品溶解後再放另一種藥品，直至全部藥品都溶解，然後加水定容到1.000毫升。
***瓊脂的添加量由1.5—2克，根據瓊脂的質量而定。凝固性能好的瓊脂，可少加一些，反之，則要多加一些。Hfr與Hfr也能接合，但重組頻率很低。細胞中的F因子使細胞壁的抗原發生了變化，這些不同於F性菌毛的表麵成分阻止了F+與F+細胞雜交。經培養後處於饑餓條件下的F+細胞喪失了它們的表麵排斥性，才能與其它F+細胞接合（這種改變是暫時的，一旦在新鮮培養基中，繼續生長正常的表麵特性又恢複），這些表型上的“F-細胞”稱為擬表型。在抑製新的F性菌毛和表麵成分形成的條件下生長，如低溫下連續通氣培養24—48小時，能增加擬表型的百分數。
1946年Lederberg和Tatum開始發現細菌的接合以後，普遍認為DNA的轉移必需F+（Hfr）與F-細胞的緊密接觸。Anderson等於1957年根據電鏡照片指出接合細胞之間形成了橋。之後發現F+（Hfr）和性菌毛之間的關係，認為細菌染色體和專一雄性噬菌體通過性菌毛而轉移。近來的電鏡照片已經發現接合細胞通過性菌毛接觸，並有實驗依據。細胞接合後，供體中的DNA開始合成。一個單鏈DNA轉移入受體並合成一條新的互補鏈；這過程能以DNA複製的滾環模型來說明。
上麵提到帶有F因子的大腸杆菌有F+和Hfr二類，實際上並不是所有的Hfr全是相當穩定的，在許多Hfr群體中含有回複子，在這些回複子中F因子不再整合在染色體上，而回複到遊離狀態，當F因子脫離寄主染色體時攜帶了細菌的基因，例如lac和gal等，這稱之為F′因子。帶有F′因子的菌稱為F′菌株。F′菌株也能與F-雜交，現被廣泛應用於細菌的研究工作。
五、實驗步驟
1.菌液製備：
（1）實驗前14—16小時，從冰箱保存的斜麵菌種，挑少量菌於盛有5毫升完全液體培養基的三角燒瓶中；每一個菌株接種一瓶，共接種4瓶，置37℃培養過夜。
（2）取出培養過夜的細菌，在W1177一瓶菌液中加入5毫升新鮮的完全培養液，充分搖勻，等量分成2瓶；其餘3瓶菌液分別用滅菌的5毫升吸管，各吸出2.5毫升菌液，然後再各加入2.5毫升新鮮的完全培養液，充分搖勻，各菌於37℃繼續培養3—5小時。
（3）自溫箱取出三角燒瓶，分別倒入離心管，菌株W1177倒二支離心管，其餘菌株各倒入一支離心管，離心沉澱，3，500轉/分，離心10分鍾。
（4）倒去上清液，打勻沉澱，加入無菌水，離心洗滌3次，再加無菌水到原體積。
2.雜交——混合培養：
（1）取12支滅菌試管，每支吸入3毫升經融化的半固體培養基，並保溫在45℃（保溫溫度不宜高，北方氣溫低，可降低半固體中的瓊脂量）。
（2）12支試管分成三個雜交組合，即W1177×K12pro；W1177×W1485；W1177×HfrC。每個組合各4支試管，其中2支對照，2支混合菌液。
（3）對照組試管各吸F+或Hfr供體菌菌液1毫升，其餘按雜交組合各吸供體菌和受體菌菌液0.5毫升，充分混勻。
（4）將各試管中含菌的半固體倒在有Vogel培養基底層的平板上，搖勻待凝，放37℃培養，48小時後觀察（圖12－3）。
六、實驗結果記錄
