包涵體的形成

主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。

　　1、表達量過高，研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至於沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。

　　2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關。

　　3、重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。

　　4、重組蛋白是大腸杆菌的異源蛋白，由於缺乏真核生物中翻譯後修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉澱。因此有人采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

　　在基因重組技術得到迅速發展之前，研究者就已經發現，細胞內人工引入反常的蛋白質（這些蛋白質可以看作是細胞的外源蛋白質），這些蛋白質會堆積起來形成不溶的形式。這些蛋白質聚集的形態是明顯的球形，這些球形的物質全部是蛋白質，並且通過非共價鍵的作用力形成，必須使用變性劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）或者鹽酸胍才能溶解。自從基因工程的蛋白質在大腸杆菌表達以後，人們逐漸發現這些外源蛋白質基因在細胞中的過量表達同樣形成不溶性的狀態。

　　Georgiou等人發現天然的蛋白質在大腸杆菌中大量表達時，如內酰氨酶和堿性磷酸酶的過量表達，都形成了包涵體，前者的包涵體在外周質，後者的包涵體存在於細胞質中。其它的宿主細胞中也發現了重組蛋白質過量表達時形成的包涵體或者聚集體，如細菌病毒、哺乳動物細胞中。

　　包涵體在一些外界壓力下也可以形成，如溫度，是影響包涵體形成與否的主要因素。有些蛋白質在高溫的情況下容易形成包涵體，這是由於這些蛋白質在高溫下容易變性而形成聚集體。所以有人認為，當蛋白質具有高的融化溫度、高的天然構象穩定性的情況下，包涵體就不容易形成。但是，對一些體內包涵體形成的研究發現，包涵體的形成先於成熟肽鏈的形成，或者是同時進行的。在研究P22尾刺蛋白質發現，盡管尾刺蛋白質有高的穩定性，結構中主要是片斷，融化的溫度是88℃，並不受SDS、蛋白質酶和熱失活的作用，但是這種蛋白質是為數不多的在細胞內形成包涵體的原核蛋白質模型。有些天然的蛋白質在高溫（391℃）表達時可以提高25%，但是這些蛋白質不能折疊成天然的狀態而形成聚集體。聚集體形成的動力學表明，這些聚集體是從部分折疊的中間體形成的。實際上，這些折疊的中間體或者形成天然的狀態，或者形成聚集體，這個過程是溫度依賴性的，溫度的升高利於聚集體的形成。當蛋白質肽鏈在高溫下表達，合成的肽鏈足夠早地轉移到低溫下時，這些蛋白質肽鏈會重新進入折疊的過程。同時，當尾刺蛋白質在允許的溫度下表達後，再把細胞轉移到高溫下，這些蛋白質肽鏈保持活性，證明了一旦蛋白質被正確的表達並折疊成正確的構象以後，則細胞內的蛋白質的穩定性和溶解性在高溫下不再改變。蛋白質在體內折疊的中間體對於溫度因子明顯敏感。

　　沙眼衣原體包涵體最近認為較高的溫度可能增加了蛋白質合成的速度、折疊中間體形成聚集體的速度以及疏水相互作用力，表達的蛋白質易於以包涵體的形式存在。

　　其它的發酵條件同樣影響蛋白質包涵體的形成，發酵液中加入蔗糖可以大大降低內酰胺酶包涵體的形成。蔗糖的作用可能是穩定天然蛋白質的結構或者防止蛋白質折疊中間體的聚集。在體外的內酰胺酶折疊複性的過程中，同樣發現複性緩衝液中加入蔗糖可以提高蛋白質的複性率。其它促重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白質的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還原態，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl。也有報道認為在豐富的培養基中有利於活性蛋白質的表達，當培養條件不佳時如供氧不足或pH控製不佳時易形成包涵體。

　　蛋白質的聚集體和包涵體不僅僅存在於重組蛋白質的表達中，是一個廣泛存在的現象。通常認為，蛋白質的聚集現象，無論細胞內還是細胞外，都是中間體不能完成折疊而形成自我聚集現象。包涵體的形成與多肽鏈的序列、表達速度、可用的伴侶分子的量以及生長的環境有關。