目的要求
1．掌握細菌抹片的製備方法和幾種常用的染色方法。
2．認識革蘭氏染色的反應特性。
操作步驟
染色是細菌學上一個重要而基本的技術。由於細菌個體微小，且半透明，如不經染色往往不易識別。因此，借助於染色法可使細菌著色，與背景形成鮮明的對比，便於在顯微鏡下進行觀察。也可根據不同的染色反應，作為鑒別細菌的一種依據。
一、載玻片處理
載玻片應清晰透明，清潔而無油漬，滴上水後，能均勻展開，附著性好，如有殘餘油漬，可按下列方法處理。
（一）滴上95％酒精2～3滴，用清潔紗布擦拭，然後以鍾擺速度通過酒精燈焰3～4次。
（二）若上法仍未能除去油漬，可再滴上1～2滴冰醋酸，用紗布擦淨，再在酒精燈火焰上輕輕拖過。
玻片潔淨後，用玻璃鉛筆在預塗材料處的背麵劃一個直徑
二、塗片方法
（一）菌落塗片方法 塗片時，左手握菌種管，右手持接種環（又稱鉑金耳）取1～2環生理鹽水，置於載玻片上，然後將接種環在火焰上滅菌，待冷後，從菌種管內釣取少許菌落，置於生理鹽水中混勻，塗成直徑
（二）菌液塗片法 用滅菌接種環沾取菌液（液體培養物、血清、乳汁、組織滲出液等）1～2接種環，均勻塗抹在載玻片上,使成直徑為
（三）血液塗片方法 先取一張幹淨無油垢邊緣整齊的載玻片，其一端沾取少許血液，以45度角放在另一張幹淨無油垢的載玻片一端，從這端向另一端推成薄而均勻的血膜，待幹後備用。
（四）組織塗片方法 先用鑷子夾持組織局部，然後以滅菌剪刀剪取一小塊，夾出後以其新鮮切麵在載玻片上壓印或塗成一薄層。
三、幹燥
塗片最好在室溫中自然幹燥。必要時，可將標本麵向上，在離酒精燈火焰遠處烘幹，切勿緊靠火焰，以免標本糊焦而不能檢查。
四、固定
有兩種固定方法
（一）火焰固定 將已幹燥好的抹片，使塗麵向上，以鍾擺速度通過酒精燈火焰四次，使固定後的標本觸及皮膚時，稍感燒燙為度。放置冷卻後，進行染色。
（二）化學固定 血液、組織髒器等抹片作姬姆薩氏染色或單染色時，不用火焰固定而用甲醇固定，可將已幹燥的抹片浸入甲醇中2～3分鍾，取出晾幹；或者在抹片上滴加數滴甲醇使其作用2～3分鍾後，自然揮發幹燥，抹片作瑞特氏染色時則不必作特別固定，染色液中含有甲醇可以達到固定目的。
抹片固定的目的是：
1．使菌體蛋白凝固附著在載玻片上，以防染色過程中被水衝掉。
2．改變細菌對染料的通透性，因活細菌一般不允許染料進入細菌體內。
3．能殺死抹片中的部分微生物。
必須注意，在抹片固定過程中，實際上並不能保證殺死全部細菌，也不能完全避免在染色水洗時不將部分塗抹物衝掉。因此，在製備烈性病原菌，特別是帶芽胞的病原菌抹片和染色時，應嚴格處理染色用過的殘液和抹片本身，以免引起病原的散播。
五、幾種常用的染色方法
（一）單染色法 隻應用一種染料進行染色的方法，如美藍染色法。
美藍染色法：在已幹燥、固定好的抹片上，滴加適量的（足夠覆蓋抹片點即可）美藍染色液，經1～2分鍾，水洗，瀝去多餘的水分，吸幹或烘幹（不能太熱），然後鏡檢。
（二）複染色法 應用兩種或兩種以上的染料或再加助染劑進行染色的方法。染色時，有些是將染料分別先後使用，有些則同時混合使用，染色後不同的細菌和物體或者細菌結構的不同部分，可以呈現不同顏色，有鑒別細菌的作用，又可稱為鑒別染色，如革蘭氏染色法，抗酸染色法，瑞特氏染色法和姬姆薩氏染色法等。
1．革蘭氏染色法
（1）在已幹燥，固定好的抹片上，滴加草酸銨結晶紫染色液，經1～2分鍾，水洗。
（2）加革蘭氏碘液於抹片上媒染，1～3分鍾，水洗。
（3）加95％酒精於抹片上脫色，約30秒至1分鍾，水洗。
（4）加10倍稀釋石炭酸複紅液複染1～2分鍾，水洗。
（5）吸幹或烘幹，鏡檢。革蘭氏陽性細菌呈藍紫色，革蘭氏陰性細菌呈紅色。
2．抗酸染色法
（1）在已幹燥，固定好的抹片上滴加較多量的石炭酸複紅染色液，將玻片置酒精燈火焰上緩緩加熱，至產生蒸汽即止（不要煮沸），維持微微產生蒸汽，經3～5分鍾，水洗。
（2）用3％鹽酸酒精脫色，直至標本無顏色脫出為止，充分水洗。
（3）用美藍染色液複染約1分鍾，水洗。
（4）吸幹或烘幹，鏡檢。抗酸性細菌呈紅色，非抗酸性細菌呈藍色。
3．瑞特氏染色法
抹片自然幹燥後，滴加瑞氏染色液於其上，為了避免很快變幹，染色液可稍多加些，或者看情況補充滴加，經1～3分鍾，加約與染液等量的中性蒸餾水或磷酸鹽緩衝液，輕輕晃動玻片，使與染液混勻，經3分鍾左右，直接用水衝洗（不可先將染液傾去），吸幹或烘幹，鏡檢。細菌染成藍色，組織、細胞等呈其他顏色。
4．姬姆薩氏染色法
（1）於5ml新煮過的中性蒸餾水中滴加5～10滴姬姆薩氏染色液原液，即稀釋成為常用的姬姆薩氏染色液。
（2）抹片經甲醇固定並幹燥後，在其上滴加足量的染色液或將抹片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分鍾，或染色數小時至24小時，取出水洗，吸幹或烘幹，鏡檢。細菌呈藍青色，組織、細胞等呈其他顏色。視野常呈淡紅色。
5．莢膜染色法
（1）塗片、幹燥 同單染色法。
（2）固定 滴加甲醇液於塗抹麵上，固定2～3分鍾。
（3）水洗 傾去甲醇液，用水輕微衝洗。
（4）染色 滴加堿性美蘭染色液數滴於塗抹麵上，染色2～3分鍾。
（5）水洗 傾去染色液，用水輕微衝洗。
（6）幹燥，鏡檢 菌體染成藍色，莢膜染成粉紅色或無色。
莢膜染色的原理：莢膜染色主要用於炭疽杆菌病料的莢膜檢查。因為炭疽杆菌莢膜係由d-穀氨酸組成的多肽所構成，而菌體的主要成分則為核蛋白，因二者著色力不同，染色水洗後，則可把莢膜上一部分染料衝洗掉，顏色變淡，故顯微鏡檢查時，在著色較深的菌體周圍看到一圈呈淡紫色的膜，即莢膜。又因堿性美蘭是一種多染性染料，故菌體染為藍色，莢膜則染成淡薔薇色。
6．芽胞染色法
（1）將有芽胞的材料作塗片、幹燥、固定。
（2）將5％孔雀綠水溶液滴加於固定好的塗片上。
（3）用木夾夾住載玻片在酒精燈火焰上加熱，使染料冒蒸汽（但不能煮沸），切勿使染料蒸幹，必要時可添加少許染料。加熱時間從冒蒸汽時開始計算約4～5分鍾。
（4）傾去染色液，待玻片冷卻後水洗至孔雀綠不再退色為止。
（5）用0.5％沙黃水溶液複染1分鍾，水洗。
（6）幹燥或烘幹後，置油鏡觀察，芽胞呈綠色，菌體呈紅色。
7．鞭毛染色法之一
（1）塗片 取10～12小時的幼齡培養菌，用1％福爾馬林水溶液製成菌液，在
（2）自然幹燥，不固定。
（3）用下述染色液加溫染色30秒到1分鍾，然後靜置1～2分鍾。
（4）染色液配製
①0.5％苦味酸水溶液（加溫溶解後過濾）1.0ml。
②20％鞣酸水溶液（加溫溶解，不過濾）1.0ml。
③5％鉀明礬水溶液（加溫溶解後過濾）0.5ml。
④10％複紅酒精溶液（配製後7天過濾）0.5ml。
上述染色液在用前，按①、②、③、④的順序混合後，即可使用（染色液現配現用）。
（4）水洗、幹燥、鏡檢。
（5）結果 菌體呈深紅色，鞭毛呈淡紅色。
8．鞭毛染色之二
（1）脫脂玻片的準備 要用新的或表麵沒有磨損痕跡的玻片。先用洗衣粉煮10～15分鍾，取出玻片用清水洗淨，再放入洗滌液中浸泡24小時左右，取出後，用自來水和蒸餾水洗淨，再用95％酒精脫脂，用火焰燒去酒精，即可使用。如不立即使用，可在脫脂後放於幹淨的盒中，或浸泡於95％酒精中，用前在火焰上燒去酒精，冷卻後使用。
（2）菌種 最好應用有冷凝水的新製瓊脂斜麵接種，培養10～12小時應用。如所用菌種久未移植，最好在這種斜麵上每天移植一次，連續移植2～3次後使用。
（3）染色液的配製
甲液：
單寧酸
FeCl3
蒸餾水 100ml
15％福爾馬林 2.0ml
1％NaOH 1.0ml
配好後，當天使用，次日效果差，第3天則不好用。
乙液：
AgNO3
蒸餾水 100ml
待AgNO3溶解後，取出10ml備用，再向餘下的90mlAgNO3中滴入濃氨水，使之成為很濃的氫氫化銀，再繼續滴加氨水變為透明，直到重新形成的沉澱物又剛剛溶解為止。再將備用的10ml AgNO3慢慢滴入，則出現薄霧，但輕輕搖動後，薄霧狀沉澱又消失，再滴入AgN03，直到搖動後仍呈現輕微而穩定的薄霧狀沉澱為止。如所呈薄霧不重，即可使用，此染劑可使用一周。如霧過重、則銀鹽被沉澱出，不宜使用。
（4）染色方法 在載玻片一端加蒸餾水一滴，再用接種環釣取少量細菌於水滴中沾幾下，將載玻片傾斜，使水滴流到另一端，然後將載玻片稍斜或平放，在空氣中幹燥後，在塗片上滴加甲液染色2～4分鍾，用蒸餾水衝洗，將殘水甩幹，或用乙液衝去水後，再加乙液染色30～60秒鍾，然後用蒸餾水衝洗，在空氣中晾幹，鏡檢。如未見鞭毛，應在整個塗片上多找幾個視野，有時隻在部分塗片上染出鞭毛來。如加乙液後，將載玻片在酒精燈上稍加熱，使其微冒蒸汽且不幹，則效果更好。
9．立克次氏體染色法
（1）塗片 以病料製成塗片。
（2）幹燥、微加溫固定。
（3）染色 滴加0.25％堿性複紅水溶液（染色液調至pH7.2～7.4），用濾紙過濾,染色4分鍾。
（4）脫色 用0.5％枸櫞酸把多餘的染色液洗脫掉。
（5）水洗
（6）複染 1％美蘭水溶液複染數秒鍾。
（7）水洗、幹燥、鏡檢。
（8）結果 立克次氏體呈紅色，其他組織細胞呈藍色。
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