重組腺病毒構建、擴增及純化基本技術操作

一 目的基因的克隆（以pshuttle-CMV質粒為例）

1.      選擇適當酶切位點，進行酶切連接，將目的片段插入pshuttl-CMV質粒多克隆位點。

2.      重組質粒鑒定： 酶切鑒定或測序。

3.      重組質粒擴增，純化並準備適量含目的基因的穿梭質粒。

4.      用PmeI單酶切線性化重組穿梭質粒，電泳鑒定質粒完全被切開。

5.      膠回收線性化質粒，以備共轉化使用。

二 共轉化

1  大腸杆菌BJ5183電轉感受態製備

從新鮮瓊脂板上挑取單個BJ5183細菌，接種於LB培養基中，37℃振搖過夜。

接種25ml過夜培養物於500ml LB培養基，37℃振搖，至OD600 達到0.4。

迅速將培養物置於冰浴中30min，至充分冷卻。

將菌液轉移至預冷的離心管中，4℃下以2500r/min離心15 min，棄培養液，回收細胞。

以10ml預冷的10%甘油洗滌沉澱，低溫離心，共兩次。

 加約1ml（適量）預冷的10%甘油重懸沉澱，稀釋懸液100倍，測量OD600，至稀釋濃度為2-3×1010個細胞/ ml (1.0 OD600約2.5×1010個細胞/ml)。分裝，-80℃或液氮保存待用。

2  病毒骨架質粒轉化大腸杆菌，擴增，純化。

3  將1-5µl (約1µg) 線性化的穿梭質粒及1µl（約100ng/µl）病毒骨架質粒（如pAdEasy-1）加入至含約40µl BJ5183電轉感受態的EP管中混勻,冰上冷卻。

4  將混合物加入電轉杯，電擊（1250-1500V/mm,5ms）。

5  電擊結束取出樣品，加入1ml SOC或LB培養液，37℃低速振蕩40min。

6  取適當體積的電擊轉化細胞液塗於數個卡那黴素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培養16-20hr。

7  次日挑取平板上長出的菌落（選擇最小的菌落）,接種於3ml含25-50mg/ml的LB培養基，37℃培養10-15hr。

8  堿裂法提取質粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質粒為可能陽性克隆，進一步酶切鑒定。以PacI單酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段（約30kb）,及一條小片段（約3.0或4.5kb）（同時可進行其它酶切鑒定），則基本確定為陽性克隆。

9  取1-5µl 陽性質粒轉化至DH5α大腸杆菌細胞（BJ5183為recA+,質粒DNA易發生突變，DH5α或JM109，XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株，可穩定擴增已鑒定的重組質粒），擴增細菌並純化質粒。

三 重組病毒質粒轉導293細胞

1  293細胞培養：轉導24小時前，以方瓶為例，接種2×106  293細胞於25cm2方瓶，使生長密度約50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）

2  以PacI單酶切重組病毒質粒（轉導25cm2方瓶約需4µgDNA），完全線性化後，乙醇沉澱，再以20 µl ddH2O溶解。

3  脂質體包裹質粒（以Lipofectamine為例）:每4µg PacI約需20µl Lipofectamine包裹.質粒及脂質體分別稀釋於500µl無血清培養基再混合,置於室溫下15-30min。

4  以無血清培養基輕輕洗滌培養瓶，另加2.5ml無血清培養基，37℃放置10min。

5  將Lipofectamine-DNA混合物加入培養瓶，37℃孵箱放置4hr。

6  4hr後，棄Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培養基（含10% FCS）。如有大量細胞漂浮，可不棄Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培養基，37℃孵育過夜，再換液。

7  培養過程中觀察細胞生長情況。約2周後可觀察到細胞病變（CPE）出現（如用pAdTrack-CMV質粒，由於含GFP，可觀察到綠色熒光）。

四 重組病毒鑒定

1  轉導10-14d後，收集細胞沉澱，加入2ml滅菌的PBS混懸，凍融細胞，離心後收集上清保存於-80℃。

2  取30-50% 步驟1中上清，感染50-70%飽和度的25cm2方瓶中293細胞。2-3d後出現明顯細胞病變。

3  感染後3-5d,當1/3-1/2細胞漂浮時收集病毒。按步驟1收集細胞並準備病毒上清。通過Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產生。

4  PCR鑒定重組病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，離心後取1-2µl作PCR。

五 重組病毒擴增，純化

1  75cm2方瓶中接種293細胞，至密度達到90%，加入適量病毒上清感染細胞。3-4d後，細胞幾乎變圓，且有一半細胞漂浮，則收集所有細胞。約500g轉速離心，棄上清。

2  以滅菌PBS重懸沉澱，反複凍融4次。4℃下7000g離心5min.病毒純化至少需要30瓶75cm2方瓶細胞。

3  CsCl連續梯度離心純化：50ml離心管中稱量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混勻，體積約為10ml。轉移至12ml超速離心管（用於SW41轉頭）中，覆蓋約2ml礦物油。平衡後，10℃下32000 rpm離心18-24hr，用注射器抽吸離心出的病毒帶。

（也可CsCl不連續梯度離心：20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，上麵小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入病毒上清液至體積達到20ml。平衡後，4℃下 23000rpm離心90min (SW28轉頭)，用注射器抽吸下層藍白色病毒帶）

4  病毒透析去鹽：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% sucrose），滅菌處理。4℃透析，更換3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存於-80℃。

六 病毒滴度測定（TCID50）

1  細胞準備:96孔板中接種100µl 293細胞,每孔細胞數約104個,以2% DMEM培養

2  稀釋病毒液準備：以2% DMEM將病毒液稀釋成8個較高濃度（如10-3-10-10），每個濃度重複10個，每孔加入病毒稀釋液100µl。另留兩排不加病毒液作為陰性對照。37℃下，孵箱培養10天。

3  10d後觀察細胞，記數每排出現CPE的孔數，計算細胞病變率。（如某一濃度各孔細胞全部病變，比率為1，如無細胞病變，則比率為0）。

4  計算T =10×101 + d (S - 0.5) /ml

d = Log 10 稀釋度（如為10倍稀釋℃，d=1）

   S = 各濃℃細胞病變比率之和

實驗室重組腺病毒常用質粒：病毒骨架質粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2

穿梭質粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV

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