致瀉性大腸埃希氏菌
致瀉性大腸埃希氏菌能使人類致病,監診表現主要為嚴重腹瀉,多數表現為敗血症。根據血清型別、毒力和所致臨床症狀可分為產腸毒素性大腸埃希氏菌(ETEC)、腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)以及腸粘附性大腸埃希氏菌(EAEC)五類。
1.常規分離鑒定技術:按照GB/T4789-2003方法進行
酶聯免疫法(ELISA):應用O157:H7多克隆抗體包被酶標板,加入適當稀釋與處理的糞便標本後,再與過氧化物酶標記的抗O157:H7抗體結合,加底物顯色,此法可直接檢測糞便中O157:H7大腸埃希氏菌抗原,結果與細菌培養法一致。
免疫磁珠分離法(IMS):用免疫磁分離法檢測牛糞便和食品標本的大腸杆菌O157:H7。可提高了大腸杆菌O157:H7感染病例的檢出率,與PCR符合率高。
2.快速酶觸反應:大腸埃希氏菌具β-葡萄糖醛酸酶,但以O157:H7為代表的腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)卻不具此酶。
毒素及毒力因子檢測:包括LT、ST、Hly、SLT、Stx、EaeA、VT、EAST等,過去多用動物或細胞培養測定,現可用其單抗以多種免疫學手段檢出,也可用基因探針技術或PCR等分子生物學技術檢測。同時檢測Hly和SLT基因,能快速檢測和鑒定EHEC菌株,並與EPEC區分開來。
基因探針和PCR技術:國內徐建煙根據溶血素hlyAB基因序列設計了鑒定EHEC的特異DNA探針,敏感性特異性達99%。Fortin將套式PCR技術和熒光探針技術相結合來檢測O157,該方法不僅可以鑒定與O157抗血清有交叉反應的菌株,而且靈敏度高,可檢測牛奶和蘋果汁中102CFU/ml,的細菌,如果先進行6h增菌,可檢測1CFU/ml的細菌。
基因芯片:Chizhikov將6個編碼大腸杆菌細菌抗原和毒力的特異基因探針(EaeA,SltI,SltII,FliC,RfbE,IpaH)點樣在玻片上,取多重PCR擴增產物與之雜交,用於同時檢測和鑒定食物中毒相關的腸道病原體,該芯片可同時檢測15種沙門菌、誌賀菌和大腸杆菌的毒力因子。
細胞粘附試驗:傳統的細胞粘附試驗是檢測EIEC的標準方法。方法為在24孔板的孔中圓形玻片上培養的HEP-2細胞單層,生長致50%;待檢菌以L肉湯培養,
3.分子流行病學分型方法
血清型分型技術:包括O、K、H、F四種抗原。O抗原共171種,其中162種與腹瀉有關,是分群的基礎。K抗原103種。從病人新分離的大腸埃希氏菌多有K抗原。根據耐熱性等不同,K抗原分為L、A、B三種,其中L、B不耐熱,有60種。F抗原至少有5種,與大腸埃希氏菌的粘附作用有關。血清型的表示方式可按O:K:H排列,例如O:K:H如O111:K58(B4):H2;O:K如O8:K88;O:H如O168:H27。
脈衝場電泳(PFGE)分型:用核糖體分型和脈衝腸電泳技術,對急性分泌型腹瀉病人中分離的ETEC病原菌分析,血清型相同的ETEC菌株具有遺傳異質性,不同血清型的ETEC菌株其PFEG型一致。美國國家公共衛生實驗室已完成了PFGE的標準化流程的製定。
隨機引物擴增DNA多態性(RAPD)和擴增片段長度多態性(FAFLP)分析分型技術:用隨機擴增多態性DNA技術(RAPD)分析,發現具有相同表型特征的ETEC菌株,用分子生物學分型方法能揭示菌株間的差異,這些差異往往在不能在對ETEC的表型中顯示出來。有學者認為FAFLP比PFGE具有更高的鑒定能力,擴增片段可精確到±1bp。
噬菌體分型:目前,通過對噬菌體感受性的不同,已獲得80餘種噬菌體型。
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