[摘 要] 代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學之後係統生物學中形成的另一重要組成部分,也是目前組學領域研究的熱點之一。代謝組學技術對理解細胞功能來講是一種十分重要的功能基因組學技術,因為代謝組直接反應了細胞的生理狀態,利用代謝組學技術很有可能去發現細胞新的生化途徑並解釋其正常的或病理的功能。該文就代謝組學所涉及的技術及其在微生物領域的應用進行綜述。
[關鍵詞] 代謝組;代謝組學;微生物
代謝活動是生命活動的本質特征和物質基礎。代謝組[1](Metabolome)是指某一組織或細胞在一特定生理時期內所有低分子量的代謝產物。代謝組學(Metabolomics)是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學之後係統生物學的另一重要組成部分,也是目前組學領域研究的熱點之一。細胞內的生命活動大多發生於代謝層麵,如細胞信號釋放、能量傳遞、細胞間通信等,代謝產物是基因表達的最終產物,基因和蛋白表達的微小變化可以在代謝物上得到放大,因此代謝組學技術對理解細胞功能來講是一種十分重要的功能基因組學技術,因為代謝組直接反應了細胞的生理狀態[2],利用代謝組學技術很有可能去發現細胞新的生化途徑並解釋其正常的或病理的功能[3]。代謝組學技術在微生物研究中的技術路線一般為:生物標本采集→數據獲取→數據分析。本文對該路線中所涉及的方法及其在微生物中的應用進行一綜述。
1 生物標本采集
研究特定條件下培養的細菌的代謝組,首先要對菌體樣品進行采集,采集菌體細胞內的代謝產物先要終止其代謝過程即淬火(quenching),然後提取(extraction)胞內代謝產物。
1.1 淬火
淬火的方法一般有:①用超濾性膜快速過濾後立即冰凍細胞[4];②用高氯酸稀釋細胞[5];③在
1.2 提取
代謝組學的分析需要通過特定的試劑把某一組織或細胞在一特定生理時期內所有低分子量的代謝產物提取(extraction)出來。最佳的提取方法應該包括以下幾點[9]:①最大限度地提取代謝產物;②對有特殊物理或化學特性的分子無特異性和吸附性;③不通過物理或化學方式破壞或修飾代謝產物。
目前提取細胞內代謝產物的方法有:①在乙醇緩衝液中煮沸細胞隨後在旋轉蒸發器中脫水[10];②用高氯酸提取[5];③
適當的取樣是代謝組學技術精確和有效的關鍵,通常的取樣技術能引起細胞內代謝產物水平出現誤差。抑製代謝物滲漏的影響、減少取樣時間的影響、數據的有效性檢查均需進一步改進。不同取樣方法聯用是覆蓋微生物細胞內代謝物範圍的最佳方法。
2 數據獲取
在細胞內代謝產物提取後緊接著就是如何對這些提取物進行分辨、鑒定和定量分析以獲取原始數據。酶分析法雖然特異性高,但是其所需樣品體積多,而且一次隻能分析一種物質。隨著色譜技術和質譜技術的發展,從小體積樣品中同時分析多種代謝產物成為了可能。目前應用比較多的方法有以下幾種[14]。
2.1 氣相色譜-質譜在代謝組學中的應用
氣相色譜-質譜(Gas chromatography coupledto mass spectrometry,GC-MS )在代謝組學研究中是很受歡迎的工具。大多數GC-MS代謝產物分析用於植物代謝組學而不是微生物和生物醫學的研究。但是,隨著代謝工程領域的快速發展和分析技術的新進展使得GC-MS在微生物代謝組學的應用越來越多。
GC-M S分離技術的優點是高分離效率(其亮點是能分辨同質異構體)、易用、耐用和低成本。GC-MS 由於高標準化地應用了電子電離,能產生廣泛的和高重複性的破裂片段,這使得能夠通過配合代謝產物的相對保留時間、滯留指數、質譜裂解譜、已知的可預言的來自數據庫的信息去鑒定代謝產物。
GC-M S最主要的缺點是分析物必須為能揮發的物質。由於大部分代謝產物是不能揮發的,因此,需進行繁複的衍生化步驟是必須的。而且,熱不穩定的化合物如磷酸化代謝產物在GC爐中接觸高溫時容易降解,加之代謝產物對衍生劑有不同的親和力,使得定量分析不準確,必須使用標準化的衍生化試劑和數據校正手段才能避免這種偏差。另外,衍生化過程中能出現副產品,而且分析物可能會發生轉變(如精氨酸轉為鳥氨酸,開鏈糖的成環)和(或)終產物的降解(如三甲基矽烷基衍生物的水解),都會引起對所產生數據的誤解。兩步衍生化方法(如矽烷化後再甲肟化)能提高待分析產物的範圍。
由於生物樣品複雜的性質而要求有效的分離操作和改良的儀器,從而導致了多維分離儀器的產生,如GC-GC tmie of flight(TOF)-MS(全二維氣相色譜/飛行時間質譜)技術。這種新方法呈現出很高的峰分辨能力並增加了敏感性,而TOF-MS對改良檢測提供了非常快的掃描率和額外的敏感性。而且,兩個不同GC柱(如極性或非極性)的使用通過選擇性的改善為代謝組學分析提供了更大的產物分析範圍。
2.2 液相色譜-質譜在代謝組學的應用
液相色譜-質譜(Liquid chromatography coup led to mass spectrometry,LC-M S)作為一種獨立的技術,在分析代謝產物時有顯著的優點,這不僅因為不必衍生化分析物,而且還具有能分辨大量代謝物的能力。LC分離與電噴霧(ESI)聯用,能使大部分代謝產物被極化和電離以更加利於鑒別。此外,還能通過離子配對(IP)LC-MS、親水作用液相色譜(H LI IC)MS和反相LC-MS技術從固定相到流動相同時定量分析不同類型的代謝產物。因而LC比GC應用範圍更廣。
B rauerMJ等[15]用H IL IC-MS測得大腸杆菌和釀酒酵母菌饑餓應急反應的代謝圖譜,在碳或氮源供斷情況下,測到68種代謝產物的濃度發生了變化。Wu L等[16]用同位素標記釀酒酵母菌提取物作為內參,用LC-ESI-MS-MS測定了釀酒酵母菌在葡萄糖刺激下的糖酵解和三羧酸循環的中間產物的濃度。LC-MS因其對樣品預處理要求簡單、檢測物質的範圍更廣等優勢,因而在代謝組學領域的應用和發展也越來越快。
2.3 毛細管電泳-質譜在代謝組學上的應用
毛細管電泳-質譜(Capillary electrophoresiscoup led to ma ss spectrome try,CE-MS )在分析複雜的代謝化合物上比GC-MS、LC-MS更有潛在的優勢,包括高分辨效率,極小的樣品量(nL),方法快捷,較低的試劑消耗。
Ohashi Y等[17]用CE-MS對大腸杆菌的陰離子、陽離子代謝產物進行了綜合和定量分析。在初級代謝中375種帶電的親水中間產物被鑒定,其中的198種被定量,進一步明確了CE-MS能用於微生物代謝領域。
CE也有一定的局限性,主要是由於其小樣品量所致的敏感性降低,尤其是與MS聯用時,樣品能進一步被屏極液稀釋。但是通過減少屏極液流速和使用聯機對樣品進行預濃縮(如PH介導的堆積和短暫的等速電泳)[18]能得到與LC-MS相似的敏感性。而且屏極液稀釋帶來的影響可通過使用無屏極界麵[3]來解決。
目前還沒有一種技術能輕易分辨微生物提取物中上百種的代謝產物。雖然理論上能精確完成,但是最廣泛的代謝產物的覆蓋度需要聯合多種能互相重疊的分離技術,通過優勢互補以分辨不同物理化學特性的化合物。
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