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腺病毒體外在293細胞中大量擴增的方法



錄入時間:2011-9-6 16:07:46 來源:腺病毒,293細胞

一旦重組病毒已被純化和鑒定,即可在293 細胞中進行大量擴增。本手冊提供了遞增培養規模和腺病毒感染周期的基本方法,按這一方法最終得到的病毒量約為3×1011~3×1012。由於一個細胞中所含的病毒顆粒為1000~10000,因此1L 培養細胞可得到約5×1012 病毒顆粒。如果要把病毒用氯化銫梯度離心純化,則必須至少3×108 的細胞,這樣才能正確分辨出病毒帶。對於蛋白表達,則根據需要可在任何一步擴增步驟中停止,離心沉澱細胞後按照適當的操作方法進行蛋白抽提(根據蛋白類型的不同抽提上清或細胞沉澱)。為優化時間進程,每個感染周期必須與下一次細胞擴增培養同步。如果由於各種原因不能同步,則必須將病毒凍存,直至下一次細胞培養開始後再融化病毒。注意每次擴增都將會剩下一些病毒,這些病毒先不必丟棄,以便下一步擴增失敗時備用。每次擴增最好都用最低代的病毒顆粒,這樣產生突變型病毒的可能性會大大降低。

操作步驟:

1 在100mm 培養皿或75cm2 培養瓶中加入10ml DMEM5%培養5×106 293 細胞。

2 取0.5ul 首次擴增的病毒保存液,加入DMEM5%至1ml,混勻,這樣稀釋得到的MOI 值約為5。

3 移去培養液,小心加入病毒混合液,切勿破壞細胞單層,十字形慢慢晃動3 次,37℃ CO2 孵箱中培養90 分鍾。

4 加入9ml DMEM5%。

5 再培養72 小時,這時在10ml 溶液中大約有5×109~5×1010 個病毒顆粒,進行MOI 測定以估計病毒顆粒。

注:如果此時得到的病毒量已足夠,可立即進行病毒滴度測定。收集細胞,600×g 離心5 分鍾沉澱細胞,去上清後加入最小體積(一般為原始體積的1/10 即1ml)病毒保存溶液重懸細胞。-200C /370C 凍融3 次,台式離心機上以最大速率離心去除細胞碎片,收集上清,然後進行病毒滴定。

1  -20℃/37℃凍融3 次。

2轉入15ml 無菌離心管中,台式離心機上以最大速率離心10 分鍾,收集上清凍存於-20 ℃或-80 ℃。

3  3 個175cm2 培養瓶中各加入107 293 細胞進行培養。

4  將3ml 細胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中,混勻。移去細胞培養液,每瓶小心加入5ml 混合液,十字形慢慢晃動混勻3 次,370C 5%CO2 孵箱中培養90 分鍾。此時MOI 值約為25。

5 加入DMEM5%至30ml。

6 再培養48~72 小時。此時10ml 培養液病毒量約為3×1010~3×1011。若需要,進行MOI 測定以估計病毒滴度。

注:如果此時病毒量已可以滿足實驗所需,則可立即進入病毒滴定步驟。600×g 離心5 分鍾收集細胞,棄上清,加入1/10 原始體積的溶液重懸細胞。-200C /370C 凍融3 次,台式離心機上以最大速率沉澱細胞碎片,收集上清,進行病毒滴定。

12. 移入50ml 離心管中,台式離心機上最大速率離心10 分鍾,取出上清保存。

13. 30 瓶175 cm2 培養瓶中每瓶各加入107 293 細胞。

14. 將45ml 細胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混勻,從培養瓶中移去培養液,加入5ml 混合液感染細胞,十字形緩慢晃動3 次混勻,370C 培養90 分鍾。此時MOI 值約為25。

15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。

16. 再培養48-72 小時,此時約有3×1011~3×1012 個病毒。若需要,進行MOI 測定估計病毒滴度。

如果要收集病毒顆粒,先收集被感染細胞,然後重懸在5ml DMEM5%中。-200C /370C 凍融3 次,離心沉澱細胞碎片。此時5ml DMEM5%中3×1011~3×1012 個病毒顆粒,濃度為6×1010~6×1011vp/ml。然後測定病毒滴度,或者用標準的氯化銫密度梯度離心法純化病毒。

在109 細胞中擴增病毒可獲得大量病毒保存液,而在1010 細胞中擴增則有一定技術性。切勿將擴增後的病毒保存液再用來感染細胞,因這會大大增加RCA 產生量。有時不得不使用純化空斑以最大可能降低RCA 產量。如果已沒有純化的空斑,那麽就不得不重新空斑純化重組病毒,鑒定克隆後再進行擴增。如果需要大於擴增4 輪後的病毒量,注意請用早期的病毒作為擴增源。比如,用第2 代病毒產生第3 代病毒。如果沒有第2 代病毒,那麽必須用第1 代病毒來產生新的第2 代病毒。按這個原則進行擴增可使RCA 水平盡可能低。

如果用於表達蛋白,則可以收集細胞後根據蛋白特點選擇適當方法抽提蛋白。細胞沉澱中一般可提取1-5mg 蛋白,建議在小規模擴增後先測定感染後抽提蛋白的最佳時間,然後再大量擴增蛋白。

腺病毒擴增

第一代

第二代

第三代

第四代

每瓶細胞數

1×105

5×106

1×107

1×107

培養瓶大小(cm2)

 

75

175

175

 

 

培養瓶數

24 孔板1 孔

1

3

30

 

 

首次擴增後的病

 

 

感染來源

稀釋的空斑

 

第二代病毒

第三代病毒

 

 

毒保存液

 

 

 

 

0.5 mL 或

 

 

每瓶接種量

0.1 mL

 

1 mL

1.5 mL

 

 

2.5×107

 

 

總培養體積

1 mL

10 mL

90 mL

900 mL

MOI

0.01

5

25

25

滴度(VP/mL)

1×108~9

5×108~9

3.3×108~9

3.3×108~9

總病毒量

1×108~9

5×109~10

3×1010~11

3×1011~12

 

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