在大腸杆菌中高效表達外源蛋白的策略（二）

l    轉錄水平調控

1.  啟動子

能在E.coli中發揮作用的啟動子很多。這些啟動子必須具有適合高水平蛋白質合成的某些特性。首先啟動子的作用要強，待表達基因的產物要占或超過菌體總蛋白的的10-30%；第二，它必須表現最低水平的基礎轉錄活性。若要求大量的基因表達，最好選用高密度培養細胞和表現最低活性的可誘導和非抑製啟動子。如果所表達的蛋白具有毒性或限製宿主細胞的生長，選用可抑製的啟動子則至關重要^[27，28]。例如，輪狀病毒的VP7蛋白能有效地殺死細胞，因此必須在嚴格控製的條件下表達^[29]。但在某些情況下，啟動子的嚴格性並不合理，因為即使最小量的基因產物也能由於其毒性而殺死細胞。如能滅活核糖體或破壞膜滲透壓的分子對細胞來說是致死性的^[30]。對宿主的毒性並不僅限於外源基因，某種自身蛋白的過量表達也能造成同樣的結果。如編碼外膜磷脂蛋白的traT基因^[31]。另外，不完全抑製的表達係統會造成質粒的不穩定，細胞生長速度的下降和重組蛋白產量的降低^[32，33]。Lanzer和Bujard曾對常用的lac啟動子-操縱子係統進行了廣泛的研究，證明操縱子放在啟動子序列的不同位置會造成70倍差異的抑製。將17bp的操縱子置於-10和-35六聚體區之間所形成的抑製比將其放在-35區的上遊或-10區的下遊要高50-70倍^[34]。啟動子的第三個特性是其簡便和廉價的可誘導性。大量生產蛋白質最常用的啟動子是熱誘導（λP_L）和化學誘導(trp)啟動子。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導的雜交啟動子tac^[35]或trc^[36]都是強啟動子，在基礎研究中應用很廣。但在大量生產人用治療性蛋白時用IPTG做誘導劑是不可取的，因為IPTG具有毒性而且價格昂貴^[37]。IPTG的這些不足至今仍限製tac或trc強啟動子在大量生產人用治療性蛋白中的應用。編碼熱敏lac阻遏蛋白^[38]的突變lacI（Ts）基因的出現使得目前能夠對這些啟動子進行熱誘導^[39，40]。另外，還出現了一些新型載體，它們允許在30℃對trc啟動子進行嚴緊調節。最近還報道了兩種不同的lac阻遏蛋白突變體，能夠同時允許熱誘導和IPTG誘導^[41，42]。盡管野生型lacI基因也能熱誘導，但不能對其進行嚴緊型調節，且不能用於lacI^q 菌株，因為溫度的變化不能遏製由lac阻遏蛋白的過量表達所造成的嚴緊性抑製^[43]。因此，該係統隻能用用於生產對宿主菌無害的一些蛋白。

冷反應啟動子盡管不象其他啟動子那樣得到廣泛的研究，但已經被證明能在低溫條件下進行有效的基因表達。噬菌體λP_L啟動子的活性在20℃時最高，隨著溫度的升高，其活性逐漸降低^[44]。P_L啟動子的冷反應由E.coli整合宿主因子，一種與DNA結合的序列特異性多功能蛋白來正調控^[45，46]。主要冷應激基因cspA啟動子同樣也被證明在低溫具有活性^[47]。對cspA和P_L啟動子進行分子剖析，鑒定了在較低溫度下參與增強轉錄的特異性DNA區域。從而開發了一係列在20℃低溫具有高活性的P_L衍生啟動子^[48]。選用冷反應啟動子的基本原理是在15-20℃的條件下，蛋白質的折疊速度隻受到輕微的影響，而作為生物化學反應，轉錄和翻譯的速度將被充分降低。這就為蛋白質折疊、產生有活性的蛋白和避免非活性蛋白聚合體即包涵體的形成提供了充足的時間，而目的蛋白的最終產量並未減少。最近新報道的一些啟動子具有諸多誘人之處,為選擇新的高效表達係統提供了方便。如非常強的pH啟動子^[49，50],重組蛋白的產量可達總蛋白的40-50%^[51]。但表達的水平會因不同的基因而有差異。因為蛋白質的合成不僅依賴於啟動子的強弱，而且有賴於轉錄的效率。

人們通常隻考慮E.coli啟動子的核心區域，即-10和-35六核苷酸區和一15-19bp的間隔序列。但有人提出核心序列以外的元件也能刺激啟動子的活性^[52]。許多研究也已證明，核心啟動子上遊的序列能夠在體內提高轉錄起始的效率^{[53，54，55]}。Gourse等證明，位於E.coli rRNA啟動子rrnB P1 -35區上遊的DNA序列即UP元件，能夠在體內和體外提高轉錄效率30倍^[56]。UP元件是作為一個獨立的啟動子組件發揮作用的，因為將其融合到其他啟動子如lacUV5中也能刺激轉錄^[57,58]。UP元件與其他啟動子融合所表現的這種轉錄增強子效應，使其有望通用於高效表達係統。盡管已經證明rRNA啟動子P1、P2的超強能力^[59]，但它們仍未被用於E.coli進行高水平表達，其主要原因是難以對其進行調控。rRNA的體內合成從屬於細胞增殖速度的控製。在細胞快速增殖期，P1和P2是活化的，當細胞處於生長的靜息期，則P1、P2被負調節。因此，rRNA啟動子在前誘導期將持續活化。在體內快速增殖的細胞中，P2的活性很弱，而且可誘導性差，但若與P1分開，P2啟動子的活性明顯升高（達到P1的70%），且對應激反應敏感。這表明在天然的串聯體中，P2是部分關閉的^[60]。Brosius和Holy^[61]將lac操縱子序列插入到rrnB rRNA P2啟動子的下遊，在帶有lacIq基因的菌株中成功地抑製了P2的活性。轉錄活性是以氯黴素乙酰轉移酶的產生和4.5s RNA的表達為標準的。然而，P2構建體的活性隻相當於tac啟動子活性的1/2，而且當rrnB P1啟動子被置於P2啟動子下遊時，不能完全抑製轉錄。有人試圖利用反轉啟動子的方向來嚴格調控rRNA啟動子。將rRNA啟動子克隆於目的基因的上遊，但轉錄方向相反。利用λ整合位點和可調控的λ整合酶來實現啟動子的反轉，從而達到進行誘導的目的，而且，在高度活化的啟動子上遊有一強轉錄終止子將避免在前誘導期可能出現的載體的不穩定性。

2. 轉錄終止子

    在原核生物中，轉錄終止有兩種不同的機製。一種是依賴六聚體蛋白rho的rho依賴性轉錄終止，rho蛋白能使新生RNA轉錄本從模板解離。另一種是rho非依賴性轉錄終止，它特異性依賴於模板上編碼的信號，即在新生RNA中形成發卡結構的一回文序列區，和位於該回文序列下遊4-9bp處的dA、dT富含區^[62,63]。雖然轉錄終止子在表達質粒的構建過程中常被忽略，但有效的轉錄終止子是表達載體必不可少的元件，因為它們具有極其重要的作用。貫穿啟動子的轉錄將抑製啟動子的功能，造成所謂的啟動子封堵^[64]。這種效應可以通過在編碼序列下遊的適當位置放置一轉錄終止子，阻止轉錄貫穿別的啟動子來避免。同樣地，在啟動目的基因的啟動子上遊放置一轉錄終止子，將最大限度地減小背景轉錄^[65]。另有資料證明，由強啟動子啟動的轉錄會使轉錄通讀到複製區，造成控製質粒拷貝數的ROP蛋白的過量表達，從而導致質粒的不穩定^[66]。另外，轉錄終止增強mRNA的穩定性^[67]，從而提高蛋白質的表達水平。如果來源於E.coli rrB rRNA操縱子的兩個轉錄終止子T1和T2串聯，則效果更好^[68]。但其他的許多轉錄終止子通常情況下都是十分有效的。

3．轉錄抗終止子

細菌中許多參與氨基酸生物合成的操縱子在其第一個結構基因的5'端含有轉錄衰減子。衰減子由特定操縱子的氨基酸產物調節。這樣關聯的帶電荷tRNA的存在就會在核糖體剪切之後引導初始轉錄本中二級結構的形成。如果沒有關聯的帶電荷tRNA，則會形成抗終止子結構，從而抑製終止子中發卡結構的形成和轉錄的終止^[69]。抗終止元件能使RNA 多聚酶越過核糖體RNA操縱子中的rho依賴性終止子即boxA^[70,71]。轉錄抗終止是有一個極其複雜的過程，其中包含許多已知和未知因子。有關這方麵的知識已有詳盡的綜述。在此我們主要討論抗終止元件在E.coli中表達外源基因的應用。

在E.coli表達係統中作用比較強、應用較廣的一個啟動子是噬菌體T7晚期啟動子^[72,73]。該係統的活性依賴於提供T7 RNA多聚酶的轉錄單元。RNA多聚酶的嚴格阻遏對防止T7啟動子的滲漏是必需的。有許多用於調節T7多聚酶表達的途徑，但每一種方法都有其各自的缺陷。Merten等通過構建一基於λP_L調節的反轉衰減T7 RNA多聚酶表達盒闡明了這一問題。可以通過在啟動子和編碼T7多聚酶的基因之間插入三個串聯排列的轉錄終止子來削弱T7多聚酶的基礎表達水平。在誘導的情況下，噬菌體λ來源的nut_L依賴的抗終止功能也可以協同來阻止轉錄終止^[74]。來源於E.colirrnB rRNA操縱子的轉錄抗終止區已被用於某些表達載體如pSE420。該載體應用trc啟動子^[75]。其基本原理是使得轉錄通過重度二級結構區，從而減少宿主RNA 多聚酶引起的轉錄提前終止的可能性。但是rrnB抗終止子在這種情況下似乎並不十分有效。

4．嚴緊型調節表達係統

可嚴緊調節的啟動子的優點使得我們能夠設計許多巧妙、可高度抑製的表達係統。這在表達那些產物對宿主的生長不利的基因時尤其有用。所用的策略包括“鋪平板”法^[76]；提高抑製基因和操縱基因的比例^[77]；用突變的噬菌體感染誘導^{[28 ]}；致弱高拷貝數載體上的啟動子活性^[78]；利用轉錄終止子和抗終止子^[79]；在拷貝數可控的質粒中使用可誘導的啟動子^[80]；使用“交叉調節”係統^[81]；共轉導使用SP6 RNA多聚酶的質粒^[82]；利用與克隆基因mRNA互補的反義RNA^[31]。最後一個巧妙的方法是反轉啟動子：在啟動子兩側為兩個λ整合位點，啟動子的方向與基因的表達方向相反，而且隻通過由λ整合酶介導的誘導位點特意性遺傳重組來完成反轉^[83,84]。

上述這些係統也各有其優缺點。即依賴固體培養基的方法不適用於大批量表達，高水平抑製係統常造成蛋白質產量的下降^[85]，這就有必要優化抑製基因和操縱基因的比例^[86]。由λ噬菌體介導的誘導更增加了係統的複雜性，利用反轉啟動子迂回方法又引入了複雜的載體結構。盡管這些表達係統大多數尚未用於蛋白質的大規模、高產量生產，但是它們為基因表達提供了重要的工具。