在大腸杆菌中高效表達外源蛋白的策略（四）

   確定將目的蛋白表達在特定的細胞室，即細胞質、細胞間質或是培養基中，需要權衡各自的利弊。

1．細胞質表達

包涵體的形成仍然是在細胞質中進行基因表達的一個主要障礙。包涵體雖然具有多方麵的好處，但這些優越之處與後期繁瑣的蛋白重新折疊工作、重疊蛋白的生物活性的未知性以及重疊和純化後蛋白的總產量降低相比，則顯得微不足道。至今尚不明了包涵體形成的精確機製。對於形成和不形成包涵體的81種蛋白質的統計學分析表明，有6個主要的理化指標與此有關。這6個指標是電荷平均數、轉變形成的殘基組分、半胱氨酸組分、脯氨酸組分、親水性和殘基總數。其中前兩個指標與包涵體形成密切相關。一種基於這些指標的模型可以根據某種蛋白質的氨基酸組成來預測包涵體形成的可能性。該模型曾成功地預測人T細胞受體Vβ5.3在E.coli中的可溶性^[130] 。

已經建立了多種策略以幫助蛋白質天然空間結構的形成^[131]。這些策略包括在較低溫度下培養細菌^[132]，選擇不同的E.coli菌株^[133]，替換某些氨基酸殘基^[134]，與分子伴侶共表達^{[135,136,137]}，利用高溶解性的多肽作為共表達分子^[138]，在山梨糖醇和甘氨酸三甲內鹽存在時，以低滲透壓培養和誘導細胞^[139]，改變培養基的pH值^[140]。與分子伴侶共表達或許是一種有望提高蛋白質可溶性和折疊效率的途徑^[141]。但這種策略似乎具有蛋白質特異性^[142]。即便在分子伴侶存在的條件下，仍有多種因素使得過量表達的蛋白不能折疊成其天然構象。這些因素包括缺乏二硫鍵和/或翻譯後修飾；細胞質的氧化還原狀態妨礙了二硫鍵的形成。在E.coli中，有兩條途徑參與二硫鍵的還原。即硫氧還蛋白係統，該係統由硫氧還蛋白還原酶和硫氧還蛋白組成；穀氧還蛋白係統，該係統由穀胱甘肽還原酶、穀胱甘肽和三種穀氧還蛋白組成^[143]。製造次還原細胞質環境，以利於二硫鍵形成的策略包括選用硫氧還蛋白還原酶（trxB）缺陷的E.coli菌株,這有助於巰基還原勢能。

蛋白質在細胞質中被降解的可能性比其他細胞室要大得多。因為在細胞質中含有大量的蛋白酶。另外，從細胞質蛋白混合物中純化目的蛋白相對比較困難，因為在此細胞室包含總細胞蛋白的絕大部分蛋白^[144]。

2．細胞外周質表達

在細胞外周質進行蛋白質表達有許多優越之處。在外周質隻有4%的總細胞蛋白，這顯然有利於目的蛋白的純化，外周質的氧化環境有利於蛋白質的正確折疊，在轉移到外周質的過程中，信號肽在細胞內剪切更有可能產生目的蛋白的天然N-末端。此外，外周質中的蛋白質降解也少得多^[145]。蛋白質通過內膜轉運到外周質需要信號肽^{[146，147，148]}。許多原核和真核細胞來源的信號肽已成功地用於Ecoli中蛋白質從內膜到外周質的轉運。如E.coli的PhoA信號^[149]、OmpA^[150]、OmpT^[151]、LamB和OmpF^[152]以及金黃色葡萄球菌的A蛋白^[153]，鼠RNase^[154]和人生長激素信號肽^[155]等。但是，蛋白質轉運到細菌外周質是一個特別複雜和尚未完全明了的過程，信號肽的存在並不總能保證有效的蛋白質通過內膜轉運^[156]。改善蛋白質轉運到外周質的策略包括提供蛋白質轉運和加工所需的成分：過量表達信號肽酶I^[157]，利用prlF突變株^[158]，共表達參與膜轉運的幾種蛋白質，降低蛋白質的表達水平以防止轉運工具的過載^[159]。

3．  細胞外分泌（外泌）

 將蛋白質分泌到細胞外是人們最期望的一種策略。因為這樣容易純化目的蛋白質，減少細菌的蛋白酶對目的蛋白質的裂解。但是，E.coli在正常情況下隻有很少量的蛋白質分泌到細胞外。要解決蛋白質外泌方麵的難題，必須弄清E.coli的分泌途徑。Pugsley^[160]對革蘭氏陰性菌的分泌途徑進行了詳細的研究。在E.coli中將蛋白質分泌到培養基中的方法大致分為兩類：（1）利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途徑^[161]；（2）利用信號肽序列、融合伴侶和具有穿透能力的因子。第一種方法具有將目的蛋白質特異性分泌的優點，並最小限度地減少了非目的蛋白的汙染。最突出的例子是溶血素基因，該基因曾被用於構建分泌的雜交蛋白^[162，163]；第二種方法依賴於有限滲透的誘導而導致蛋白質的分泌。例如應用pelB^[164]、ompA[^165]和A蛋白引導序列^[153，166]；與細菌素釋放蛋白的共表達^[167]；絲裂黴素誘導的細菌素釋放蛋白和在培養基中添加甘氨酸^[168]以及與kil基因共表達而進行膜穿透^[169]。但通常情況下，外泌蛋白質的產量是中等的。有文獻報道^[170]，在大腸杆菌表達係統中，金黃色葡萄球菌A蛋白的信號肽能引導帶有E結構域的A蛋白片段或融合產物從細胞質外泌到培養基中，蛋白的外泌表達發生於細胞生長後期。但所用的啟動子為A蛋白自身的啟動子，該啟動子在大腸杆菌中為非可控性的組成性表達，且強度較弱。如果能利用可控的強啟動子進行A蛋白信號肽引導的基因表達，則有望在蛋白質外泌方麵有所突破。目前我們正在進行這方麵的嚐試，且已經取得初步成效。