分子伴侶
目前已經達成共識，有效的蛋白質翻譯後折疊、多肽裝配成寡聚體結構以及蛋白質的轉位都是由一種被稱為分子伴侶的專職蛋白來介導的[200]。原核生物的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶在E.coli中的有效合成和裝配需要GroES和GroEL蛋白的證據，使得利用分子伴侶在E.coli中進行基因高效表達成為近來研究的熱點[201]。但是，利用分子伴侶所得到的實驗結果並不一致，而且迄今為止，伴侶分子的共表達對基因表達的影響似乎都具有蛋白質特異性[202]。目前尚不清楚在基因過度表達的情況下，分子伴侶的體內水平是否受到限製。正常情況下，蛋白質的折疊最終達到一種熱力學的穩定狀態。特別不穩定的蛋白即使在伴侶分子存在的情況下，或許也不能正確折疊。因此，多肽鏈的截斷、多亞基蛋白複合物單個結構域的產生、缺乏維持蛋白質正常結構的二硫鍵的形成以及缺乏翻譯後的修飾如糖基化等，都將不可能達到熱力學的穩定狀態。現在已經明白不同類型的伴侶分子正常情況下是協同發揮作用的[203]。因此，隻過度表達單一的伴侶分子可能不太有效。在某些情況下，共表達與靶蛋白來源相同的伴侶分子可能是必要的。還有一個需要考慮的變量是培養溫度。例如，在30℃時GroES-GroEL共表達能夠提高β-半乳糖苷酶的產量，而在37℃或42℃則不能[204]。最後，伴侶分子的共表達有可能導致表型的改變如細菌絲狀生長，這有可能對細菌的生存和蛋白質的產生不利[205]。最近有報道表明，將人或鼠的蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）與靶基因共表達，能提高在E.coli細胞質中正確折疊蛋白質的產量[206，207]。E.coli細胞質中二硫鍵的形成是由維持氧化還原電勢的一組蛋白質來促進的[208]。有人認為DsbA（一種可溶性的細胞外周質蛋白）直接催化蛋白質中二硫鍵的形成，而DsbB（一種內膜蛋白）則參與DsbA的再氧化。真核生物的PDI能夠補充dsbA缺失突變株的表型，但其功能在dsbB突變株中完全喪失。另外，通過額外添加穀胱甘肽可以提高PDI增強靶蛋白產生的能力。這些證據表明，PDI有賴於細菌氧還蛋白來完成自身的再氧化[207]。
培養條件
E.coli中的蛋白質產量可以通過高細胞密度培養係統而獲得顯著提高。高細胞密度培養係統可以分成三類：分批培養、補料分批培養和連續培養。這些方法能獲得超過100g/升的細胞濃度，從而獲得廉價的重組蛋白。有關大規模培養係統的資料已有詳細的綜述[193，209]。培養基的組成需要仔細地計算和監控，因為這對細胞和蛋白質的產生具有重要的代謝效應。例如，不同mRNA的翻譯可以因溫度和培養基的變化而受到不同程度的影響[210]。營養成分和培養參數如pH、溫度和其他參數都會影響蛋白酶的活性、分泌和產量[211]。已經證明對培養基的特殊操作能明顯提高蛋白質釋放到培養基中。例如，在培養基中添加甘氨酸能增強外周質蛋白釋放到培養基中，且不引起明顯的細菌裂解[212，213]。同樣，在山梨糖醇和甘氨酰甜菜堿存在的滲透壓力下培養細菌，可以使可溶性的活性蛋白產量提高多達400倍[139]。
高細胞密度培養係統也有其自身的缺陷。這些缺陷包括在高細胞密度情況下，溶解氧的量有限；二氧化碳水平能夠降低生長速度、刺激乙酸形成降低發酵罐的混合效率和產熱等。有關這些問題的解決方案已經有詳細的介紹[193]。利用高細胞密度培養係統生產重組蛋白質的一個主要問題是乙酸的積累，這種親脂性成分對細胞的生長是有害的[193]。雖然有多種解決這一問題的方案，但是均各有缺點。近來這一問題通過將來自B. subtilis編碼醋酸鹽合成酶的alsS基因導入E.coli細胞中得以解決[141]。該酶催化丙酮酸轉化為非酸性和低毒性的副產品。乙酸積累的減少極大地改善了重組蛋白的產生。另外，其他酶缺陷的E.coli突變株也已經建立，這些突變株產生較少的乙酸，從而提高了人重組蛋白的表達水平[214]。
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