二、瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳技術(Agarosegelelectroghoresis)是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。凝膠分辨率決定於使用材料的濃度,並由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳是一個電場作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應,此外,在弱堿性條件下,DNA分子帶負電荷,從負極向正極移動。根據DNA分子大小、結構及所帶電荷的不同,它們以不同的速率通過介質運動而相互分離。借助溴化乙錠(EB)能與雙鏈DNA結合的作用,利用EB染色,並通過紫外線激發即可觀察被分離DNA片段的位置。
【材料】
1、瓊脂糖、10×TAE電泳緩衝液(40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTA,PH8.0)
2、載體緩衝液(0.25%溴酚藍,30%甘油)、溴化乙錠水溶液(10mg/ml)
3、凝膠槽、電泳儀
【方法】
1、取瓊脂糖0.9g,加入100ml1xTAE電泳緩衝液於250ml燒瓶中,100℃加熱溶解。
2、平衡凝膠槽,放好兩側擋板,調節好梳子與底板的距離(一般高出底板0.5~1mm)。
3、鋪板:在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液,輕輕混勻,待冷至500C左右倒入凝膠槽,膠厚一般為5~8mm。
4、待膠徹底凝固後,去掉兩側擋板,將凝膠放入盛有電泳液的槽中(加樣孔朝向負極端,DNA由負極向正極移動),使液麵高出凝膠2~3mm,小心拔出梳子。
5、DNA樣品與載體緩衝液5:1混合並加入凹孔中(樣品不可溢出)。
6、打開電源,調節所需電壓,電壓與凝膠的長度有關,一般使用電壓不超過5v/cm。
7、據指示染料移動的位置,確定電泳是否終止(溴酚藍的湧動距離在5sRNA和0.3kbDNA帶之間)。
8、電泳完畢關閉電源。將凝膠放紫外燈下觀察並拍照。