微生物快速檢測方法及應用進展

【關鍵詞】  微生物快速檢測

隨著人們生活水平不斷提高，各種安全問題越來越受到人們的重視，微生物的汙染問題也相應地備受關注。在食品和環境等各個方麵都有微生物汙染的可能，一旦汙染，微生物將大量繁殖而導致食源性疾病或環境汙染甚至醫院內感染。特別是近年來隨著環境汙染的加劇和生態平衡的不斷破壞，導致感染的致病菌的種類越來越多，病原微生物對人類的威脅越來越大。傳統的檢驗方法，主要包括形態檢查和生化方法，其準確性、靈敏性均較高，但涉及的實驗較多、操作煩瑣、需要時間較長、準備和收尾工作繁重，而且要有大量人員參與［1，2］。所以，迫切需要準確、省時、省力和省成本的快速檢驗方法。本文對微生物快速檢測方法的進展情況及實際應用進行綜述，以利於預防食源性疾病及公共衛生突發事件的發生。

    1  即用型紙片法

    　　3M公司的perrifilmTMPlate係列微生物測試片，可分別檢測菌落總數、大腸菌群計數、黴菌和酵母計數［3］。由RCP Scientific Inc 公司開發上市的Regdigel係列，除上述項目外還有檢測乳杆菌、沙門氏菌、葡萄球菌的產品［4］，這兩個係列的產品與傳統檢測方法之間的相關性非常好。如用大腸菌群快檢紙片檢測餐具的表麵，操作簡便、快速、省料，特異性和敏感性與發酵法符合率高，已經被列為國標方法。使用時應正確掌握操作技術和判斷標準，從而達到理想的檢測效果［5］。美國3M公司生產的PF(Petrifilm)試紙還加入了染色劑、顯色劑，增強了菌落的目視效果，而且避免了熱瓊脂法不適宜受損細菌恢複的缺陷。黴菌快速檢驗紙片，應用於食品檢驗中的黴菌具有操作簡便，僅需36℃培養，不需要低溫設備；快速，僅需2 d就可觀察結果，比現在的國家標準檢驗方法縮短3～5 d，大大提高了工作效率。紙片法與國標法在黴菌檢出率上差異無統計學意義，且菌落典型，易判定。紙片熒光法利用細菌產生某些代謝酶或代謝產物的特點而建立的一種酶—底物反應法。隻需檢測食品中大腸菌群、大腸杆菌的有關酶的活性，將熒光產物在365 nm紫外光下觀察即可。同時紙片可高壓滅菌處理，4℃保存，簡化了實驗準備、操作和判斷［6］。但由於它們價格昂貴，限製了在基層單位的實際應用。

    2  生物化學技術

    2.1  PCR技術  PCR技術采用體外酶促反應合成特異性DNA片段，再通過擴增產物來識別細菌。由於PCR靈敏度高，理論上可以檢出一個細菌的拷貝基因，因此在細菌的檢測中隻需短時間增菌甚至不增菌，即可通過PCR進行篩選，節約了大量時間，但PCR技術也存在一些缺點：食物成分、增菌培養基成分和其他微生物DNA對Taq酶具有抑製作用，可能導致檢驗結果假陰性；操作過程要求嚴格，微量的外源性DNA進入PCR後可以引起無限放大產生假陽性結果，擴增過程中有一定的裝配誤差，會對結果產生影響。由於以上原因，PCR技術對操作者的自身素質要求很高，對於基層單位而言難以做到。短時間內也不會有經濟效益和社會效益，因此影響了這項技術在基層的應用。

    2.2  基因探針技術  基因探針技術利用具有同源性序列的核酸單鏈在適當條件下互補形成穩定的DNARNA或DNADNA鏈的原理，采用高度特異性基因片段製備基因探針來識別細菌。基因探針的優點是減少了基因片段長度多態性所需要分析的條帶數。如法國生物一梅裏埃公司的GENPROBE基因探針檢測係統，對於分離到的單個菌落，30 min完成微生物的確證試驗［7］，基因探針的缺點是不能鑒定目標菌以外的其他菌。

    3  選擇、鑒定用培養基法

    　　在培養基中加入特異性的生化反應底物、抗體、熒光反應底物、酶反應底物等，可使目標培養物的選擇、分離、鑒定一次性完成。如生物一梅裏埃公司的BP+RPF(兔血漿+纖維蛋白原)培養基，可在24 h內鑒定金黃色葡萄球菌［8］。Merk公司的chromocult Coliform Agar培養基上，大腸杆菌為墨綠色至紫色菌落，沙門菌為淡綠色至藍綠色菌落。檸檬酸杆菌和克雷伯杆菌為橙紅色至紅色菌落，其他腸道菌為無色菌落［9］。這個方法對操作者要求不高，短期培訓合格後即可上崗，從而取得一定的經濟效益和社會效益，應用前景十分廣泛。

   4  免疫學技術

    免疫學技術通過抗原和抗體的特異性結合反應，再輔以免疫放大技術來鑒別細菌。免疫方法的優點是樣品在進行選擇性增菌後，不需分離，即可采用免疫技術進行篩選。由於免疫法有較高靈敏度，樣品經增菌後可在較短的時間內達到檢出度，抗原和抗體的結合反應可在很短時間內完成［10］。此技術對操作者要求也不高，是目前為止基層單位應用時間最長最為廣泛的一項快速檢測技術。如采用免疫磁珠法可有效地收集、濃縮神奈川現象陽性的副溶血性弧菌，可顯著提高環境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率［11］。膠體金免疫層析法能快速、靈敏檢測金黃色葡萄球菌［12］，應用膠體金免疫層析法檢測乙型肝炎表麵抗原，可大大提高工作效率［13］。ATP生物發光法是近年發展較快的一種用於食品生產加工設備潔淨度檢測的快速檢測方法。利用ATP生物發光分析技術和體細胞清除技術，測量細菌ATP和體細胞ATP， 細菌ATP的量與細菌數成正比，用ATP生物發光分析技術檢測肉類食品細菌汙染狀況或食品器具的現場衛生學檢測，都能夠達到快速適時的目標［14，15］。微型自動熒光酶標分析法(mini VIDAS)是利用酶聯熒光免疫分析技術，通過抗原-抗體特異反應，分離出目標菌，由特殊儀器根據熒光的強弱自動判斷樣品的陽性或陰性。VIDAS法檢測凍肉中沙門菌具有很高的靈敏度和特異性，用於進出口凍肉的檢測，可大大縮短檢驗時間，加快通關速度［16］，檢測凍肉中李斯特氏菌亦如此［17］。

    5  細菌直接計數法

    主要包括流式細胞儀(flow cytometry，FCM)和固相細胞計數(solid phase cytometry，SPC)法。FCM通常以激光作為發光源，經過聚焦整形後的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產生散射光和激發熒光。光散射信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的強度則代表了所測細胞膜表麵抗原的強度或其核內物質的濃度，由此可通過儀器檢測散射光信號和熒光信號來估計微生物的大小、形狀和數量。流式細胞計數具有高度的敏感性，可同時對目的菌進行定性和定量鑒定［18］。目前已經建立了細菌總數［19］、致病性沙門菌、大腸埃希氏菌［20］等的FCM檢驗方法。固相細胞計數可以在單個細胞水平對細菌進行快速檢測［21］。濾過樣品後，存留的微生物在濾膜上進行熒光標記，采用激光掃描設備自動計數。每個熒光點可直觀地由通過計算機驅動的流動台連接到ChemScan上的落射熒光顯微鏡來檢測，尤其對於生長緩慢的微生物檢測用時短，使該方法明顯優於傳統平板計數法［22］。此方法要求配備特殊的儀器，財政投入較大，因此基層單位目前暫時無法應用。

    6  全自動微生物分析係統(AMS)

    AMS是一種由傳統生化反應及微生物檢測技術與現代計算機技術相結合，運用概率最大近似值模型法進行自動微生物檢測的技術，可鑒定由環境、原料及產品中分離的微生物。AMS僅需4～18 h即可報告結果，以常規法鑒定細菌，隻能得到是或不是某種菌，要想知到是哪種菌還要做大量、煩瑣的生化試驗，而AMS則可以直接報告是什麽菌［23］。法國生物梅裏埃集團公司出品的VitekAMS自動微生物檢測係統屬當今世界上最為先進、自動化程度最高的細菌鑒定儀器之一。Vitek對細菌的鑒定是以每種細菌的微量生化反應為基礎，不同種類的Vitek試卡(檢測卡)含有多種的生化反應孔，可達30種，可鑒定405種細菌［24］。用AMS明顯縮短腸道菌生化鑒定的時間，如鑒定沙門菌屬隻需4 h，鑒定誌賀氏菌屬隻需6 h，鑒定霍亂弧菌等致病性弧菌亦隻需4～13 h［22］183-186。這套係統對基層單位而言具有極強的應用價值，但他昂貴的價格讓人望而生畏。

    總之，隨著現代科技的發展，可以預料在不遠的將來，傳統的微生物檢測技術將逐漸被各種新型簡便的微生物快速診斷技術所取代。近年來興起的基因探針技術及全自動微生物檢測係統，將從根本上改變微生物的檢測方法，具有非常廣闊的應用前景。

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