【摘要】 目的 ：從環境中分離高產脂肪酶的細菌，並克隆其脂肪酶基因。方法：從天然高油脂含量土壤篩選高產脂肪酶的細菌，鑒定菌種後，設計相應引物PCR擴增脂肪酶基因並進行TA克隆，重組載體轉入E.coli DH5α構建工程菌，雙酶切及測序鑒定脂肪酶基因。結果：經過微生物菌種鑒定獲得4株高活力菌，其中一株金葡菌產酶最高，利用PCR技術成功擴增脂肪酶基因，該基因經過克隆測序及其雙酶切鑒定證實為新發現的突變脂肪酶基因，其二級結構與標準基因(EU310372)有較大不同。結論：成功分離一株高產脂肪酶的菌株——金黃色葡萄球菌，克隆的脂肪酶基因為新發現的突變型。
【關鍵詞】 脂肪酶基因；PCR；TA克隆
Abstract: Objective: To separate natural bacteria producing high activities lipase from environment，and clone its lipase gene. Methods: High activities lipase producing bacteria was screened from soil which contained plenty of oils and fats. After identifying bacteria，PCR amplified lipase gene which was cloned to pMD18-T Vector. The recombint plasmid was transformed into E. Coli DH5αto build the engineering bacteria. At last，the lipase gene was identified with two restriction endonuclease digesting and sequencing. Results: After identifiying，4 producing high activitie lipases bacteria strains were obtained，one of which was a Staphylococcus aureus producing highest activities lipase，its lipase gene was amplified by PCR，then separated and identified as a new mutant lipase gene by restriction endonuclease digesting and sequencing. standard lipase gene registered on NCBI (EU310372)，The secondary structure of the new mutant lipase gene was more different from standard lipase. Conclusion: A strain of high activities lipase producing bacteria-Staphylococcus aureus is successfully isolated and the cloned lipase gene is a new discovered mutant type.
Key words: lipase gene；PCR；TA cloning
脂肪酶是一類酯鍵水解酶，廣泛存在於微生物、植物種子及動物組織中，能在油水界麵上催化脂類物質分解、合成和酯交換反應。作為重要的工業用酶，脂肪酶在醫藥、食品、製革、飼料、洗滌、油酯化工等傳統工業領域有著廣泛的應用，如可添加在洗滌劑增加去油脂能力，添加在高脂食物以增加口感，而近年來其在生物能源、有機合成、藥物手性拆分和工具酶等新領域也展現了良好的應用前景[1]。以上領域應用的脂肪酶，或為天然菌分離或為基因重組來源，但其微生物來源脂肪酶應用最廣泛[2-5]。據統計，細菌有28個屬，放線菌有4個屬，酵母菌有10個屬，其他真菌有23個屬，共計達65個屬的微生物產脂肪酶。而動物脂肪酶、植物脂肪酶由於其作用底物譜窄，體外表達活性、產量低，該類基因很少作為基因工程的脂肪酶來源基因[6-8]。
本課題擬通過從高含油脂的環境中分離到產高活力脂肪酶的微生物並克隆高活力脂肪酶基因，為後續的獲得工程菌清除高油脂汙水、獲得較高活力脂肪酶基因並通過基因工程獲得高活力、高產量的重組脂肪酶研究打下一定基礎。
1 材料和方法
1.1 主要試劑
E.coli DH5α由溫州醫學院浙江省醫學遺傳學重點實驗室提供；限製性內切酶Ndel，Hind III，NcoI，XhoI，pMD-18 T vector，T4連接酶、Tag DNA聚合酶、膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0）、基因組提取試劑盒，均購自寶生物工程有限公司；橄欖油、聚乙烯醇（PVA）、溴甲酚紫購自上海三愛思試劑有限公司。
1.2 產脂肪酶天然菌株的篩選及鑒定
產脂肪酶細菌主要從自然界中篩選，采集溫州汽車站，茶山鎮及溫州醫學院茶山校區周圍的油汙豐富的土壤，供分離使用。共采集到土壤樣品14份(包括:河道汙泥、餐廳廚房清洗處汙泥、菜市場肉案上木屑、修車店門前汙泥、飲食店油煙機油漬等)。篩選方法是：樣品經富集培養、平板初篩(觀察變色圈大小)，最後經搖瓶複篩(測酶活力大小)，具體的配方及操作參照文獻[9]。將分離到的菌株用法國梅裏埃微生物鑒定儀鑒定，然後進行酶活測定。
1.3 天然菌基因組提取的優化
運用了試劑盒法、酚-氯仿法、煮沸法三種方法分別提取金黃色葡萄球菌全基因組，並經PCR擴增脂肪酶基因[10]，比較三種方法的優缺點，為後續實驗提供一定的基礎。
1.4 脂肪酶基因的克隆
根據NCBI上公布的一些常見的細菌脂肪酶基因設計了8對通用引物（見表1）。
用8對引物分別對分離出的菌株進行脂肪酶基因的擴增。PCR反應條件I為：94 ℃預變性5 min，再循環30次：94 ℃變性55 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸150 s，最後1個循環72 ℃延伸10 min，適用於引物3、5、8的擴增。PCR反應條件II為：94 ℃預變性5 min，再循環30次：94 ℃變性55 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，最後1個循環72 ℃延伸10 min，適用於引物1、2、4、6、7的擴增。PCR反應體係為50μL體係。PCR產物用經試劑盒純化，用T4連接酶於與pMD18-T Vector，16 ℃連接2 h後，轉化感受態E.coli DH5α細菌，再將少許菌液塗布在含有X-Gal，IPTG，Amp的L-瓊脂平板培養基上培養，進行藍白斑篩選驗證試驗。
1.5 pMD18-T Vector重組載體鑒定
挑取上步驟中單個白色菌落擴大培養，提取質粒[11]，雙酶切電泳鑒定。同時將單個白色菌落的菌液送上海生工測序。
1.6 脂肪酶測序分析及二級結構預測分析
運用軟件CodonCode Aligner分析測序結果，SPSS 11.0統計學軟件對其進行統計分析，通過在線免費軟件PredictProtein分別對人工分離到的金葡菌脂肪酶和NCBI上注冊號EU310372脂肪酶進行二級結構預測分析[12]。
