微波法快速提取絲狀真菌基因組DNA

【摘要】  絲狀真菌基因組DNA的提取是一個費時、費力，並且費用較高的工作，效率較低。本文報道一種以微波熱振破壁處理真菌菌絲，快速、簡便和高效提取真菌基因組DNA的方法。以提取的DNA為模板可以擴增出18S rRNA基因。

【關鍵詞】  微波法； 絲狀真菌； 基因組DNA提取；

絲狀真菌廣泛存在於自然界中，在工農業生產中占據非常重要的地位［1］。絲狀真菌資源的開發需要對大量的菌種進行快速篩選、鑒定和改良。分子技術的發展使對真菌進行快速和高效鑒定與改良成為現實，因此迅速、方便、實惠的真菌DNA提取就顯得相當重要。真菌因為有不同於細菌的細胞壁，而且真菌中有較多的多糖成分影響到所提DNA的質量和後續的分析。平常的方法如提取放線菌、細菌的DNA方法不適合真菌基因組DNA的提取，而常用的酶法或液氮破壁的方法在實際操作中因為成本和儲存條件的問題使其應用受到局限。許多學者對絲狀真菌基因組DNA的提取方法進行了摸索和改進［2，3］。微波爐已成為實驗室的常規設備之一，徐平等［4］用微波法提取放線菌DNA得到較好的結果。受此啟發，我們把微波法應用到真菌基因組DNA提取中，找到一種新的提取絲狀真菌基因組DNA的方法。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    (1)菌種  見表1。

    (2)試劑緩衝液為50mmol/L TrisHCl，pH7.7，25mmol/L EDTA，0.1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；裂解液為50mmol/L TrisHCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，3% SDS，1.2% PVP；抽提液為10mmol/L TrisHCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，0.3mol/LNaAc，1.2% PVP；18S rRNA基因擴增引物為F181f(5′ACCTGGTTGATCCTGCCAG3′)和F182b(5′ATCCTTCCGCAGGTTCACC3′)由上海生工合成，    表1    實驗菌株

    編號菌    種        菌號1  Stachybotrys chlorohalonata  SIIA 15072  Stachybotrys dichroa  SIIA 15503  Aspergillus carbonarius  SIIA 15844  Aspergillus wentii  SIIA 15945  Aspergillus sp.  SIIA 16386  Aspergillus sydowii  SIIA 16327  Penicillium sp.  SIIA 17098  Penicillium brevicompactum  SIIA 17159  Penicillium brevicompactum  SIIA 174610  Penicillium expansum  SIIA 170811  Mariannaea sp.  SIIA 1299712  Nectria mariannaeae    SIIA 1236113  Gibberella fujikuroi  SIIA 14231

    SIIA：中國醫藥集團四川抗菌素工業研究所抗生素微生物

    資源中心。

    Taq酶購自北京天根公司。絲狀真菌斜麵培養選用PDA培養基，菌絲收集選用液體培養基，成分為：水解酪素0.05g，蔗糖1.5g，酒石酸銨0.5g，NH4NO3 0.1g，K2HPO4 0.1g，NaCl 0.01g，CaCl2 0.01g，H2O 100ml；pH自然。

    1.2  方法

    (1)菌體準備  將菌種接種於PDA斜麵培養基上，26℃培養3d，挑菌於100ml液體培養基中，在220r/min的搖床上於26℃培養3～4d，離心收集菌體，用無菌蒸餾水洗滌菌絲3次，保存於-20℃冰箱。

    (2)DNA提取  用無菌竹簽挑取菌絲體1g加入研缽中， 加入300μl的緩衝液，並加入預先準備好的0.5g的酸洗石英砂，研磨至菌落分散至單個細胞，即無成團菌絲體存在。將研磨液吸入1.5ml的滅菌EP管中，加入100μl預熱至35℃的裂解液，並且震蕩搖勻5s，將EP管的蓋子打開，放入功率為600W的微波爐中，微波時間100s(注意不要使菌液受熱過度而噴出來。可以分20s一次，加熱5次，每加熱一次就拿出來震蕩一次，使裂解液和細胞混勻)。微波後加入400μl的65℃預熱的抽提液，倒置震蕩5s。加入600μl的Tris飽和酚氯仿抽提，混勻5s，12000r/min離心5min。取離心後的上清液入另一隻滅過菌的EP管中，加入等體積的異丙醇沉澱(或用兩倍體積冰凍無水乙醇沉澱)。離心沉澱。用70%的乙醇再洗滌一次，離心後倒出乙醇，風幹EP管，至無酒精氣味後，加入30μl TE溶液(pH8.0)溶解，存於-20℃的冰箱中備用。

    (3)基因組DNA檢測  各菌種DNA樣品取出2μl用於0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，用120V電壓電泳40s後染色，在320nm紫外燈下觀測。

    (4)18S rRNA基因擴增  將提取的基因組DNA以一定的稀釋度稀釋後作為模板進行擴增，20μl體係包括1μl模板DNA，1μl Taq酶，2μl反應緩衝液，終濃度為2.5mmol/L的Mg2+，終濃度為100pmol的引物，2μl 250mmol/L dNTP。反應程序為：95℃ 4min，95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 2min，30個循環，循環結束後72℃延伸10min，反應在BioRad公司的Mycycler上進行。

    2  結果與討論

    利用微波對6個屬的13株絲狀真菌進行DNA抽提研究，發現可以非常簡便的抽提出基因組DNA，在電泳圖上可以看見>20kb有清晰的條帶(圖1)，並且以抽提出的DNA為模板，可以有效地擴增出18S rRNA基因(圖2)。

    真菌的破壁方法很多，常見的有液氮研磨和酶法溶胞，這兩種方法都有各自的局限性，液氮不容易保存和使用，針對少量的樣品而購買和儲存液氮顯得麻煩，一般的實驗室也很少有液氮儲存罐。酶法主要采用蝸牛酶和溶壁酶破壁［5］，由於酶類較昂貴所以成本較高。我們的實驗中對不同真菌的酶法處理效果不理想。有的實驗室用溶壁酶處理，也是因為不易購買和價格過高而不能普遍運用。

    Orsini等［6］較早運用微波法直接從土壤等環境樣品提取細菌基因組DNA，可有效提取環境生物的基因組DNA，微波法提取基因組DNA在放線菌中已有運用［4］，本研究證實微波法對真菌基因組DNA的提取也有較好的結果，微量的菌種就可以提出相當好的DNA，而且條帶清晰。能很好的用於後續的基因擴增。

    微波法提取真菌DNA有很多優點：①耗材少，費以微波法提取的基因組DNA為模板進行18S rRNA基因的擴增產物電泳圖譜用少，所用的試劑都是一些常用的不貴的試劑，儀器也常見，研缽，微波爐，恒溫水浴鍋，12000r/min的離心機，避免了酶法溶胞和液氮破壁的高成本；②時間短，步驟簡單，避免了液氮破壁的費時費力和酶法溶胞的費時，2h就能提出效果很好的基因組DNA；③效果好，質量高。綜上所述微波法提取真菌基因組DNA是一種廉價，方便，迅速，簡單，高質量的方法。

【參考文獻】
  ［1］ 閆培生，羅信昌，周啟. 絲狀真菌基因工程研究進展［J］. 生物工程進展，1999，19(1)：36～41.

［2］ 吳琦，王紅寧，劉世貴. 三種黑曲黴細胞基因組DNA提取方法的比較［J］. 生物技術，2003，13(6)：30～31.

［3］ 何月秋. 真菌菌絲體培養和提取DNA方法的改進［J］. 菌物係統，2000，19(3)：434.

［4］ 徐平，李文均，徐麗華，等. 微波法快速提取放線菌基因組DNA［J］. 微生物學通報，2003，30(4)：82～84.

［5］ 李紹蘭，周斌，楊麗源，等. 真菌DNA提取方法的改良［J］. 雲南大學學報(自然科學版)，2002，24(6)：471～472.

［6］ Orsini M, RomanoSpica V. A microwavebased method for nucleic acid isolation from environmental samples ［J］. Lett Appl Microbiol,2001,33(1):17～20.

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