一、無菌技術
微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且無處不在。因此，在微生物的研究及應用中，不僅需要通過分離純化技術從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養物的“純潔”，防止其他微生物的混入。在分離、轉接及培養純培養物時防止其被其他微生物汙染的技術被稱為無菌技術（aseptic technique），它是保證微生物學研究正常進行的關鍵。
1. 微生物培養的常用器具及其滅菌
試管、玻璃燒瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最為常用的培養微生物的器具，在使用前必須先行滅菌，使容器中不含任何生物。培養微生物的營養物質（稱為培養基（culture medium））可以加到器皿中後一起滅菌，也可在單獨滅菌後加到無菌的器具中。最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養基的營養成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫幹熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌汙染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及矽膠帽，它們隻可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。而平皿是由正反兩平麵板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的汙染而設計的。
2. 接種操作
用接種環或接種針分離微生物，或在無菌條件下把微生物由一個培養器皿轉接到另一個培養容器進行培養，是微生物學研究中最常用的基本操作。由於打開器皿就可能引起器皿內部被環境中的其他微生物汙染，因此微生物實驗的所有操作均應在無菌條件下進行，其要點是在火焰附近進行熟練的無菌操作（圖2-1），或在無菌箱或操作室內無菌的環境下進行操作（圖2-2）。操作箱或操作室內的空氣可在使用前一段時間內用紫外燈或化學藥劑滅菌。有的無菌室通無菌空氣維持無菌狀態。
用以挑取和轉接微生物材料的接種環及接種針，一般采用易於迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金等金屬製備，使用時用火焰灼燒滅菌。而移植液體培養物可采用無菌吸管或移液槍。
二、用固體培養基分離純培養
單個微生物在適宜的固體培養基表麵或內部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞生長群體，稱為菌落（colony）。當固體培養基表麵眾多菌落連成一片時，便成為菌苔（lawn）。不同微生物在特定培養基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩定的特征，可以成為對該微生物進行分類、鑒定的重要依據（圖2-3）。大多數細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養。所謂平板，即培養平板（culture plate）的簡稱，它是指固體培養基倒入無菌平皿，冷卻凝固後，盛固體培養基的平皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養基表麵或裏麵。固體培養基用瓊脂或其它凝膠物質固化的培養基，每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便於移植。最常用的分離、培養微生物的固體培養基是瓊脂固體培養基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養的技術簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。
先將待分離的材料用無菌水作一係列的稀釋（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然後分別取不同稀釋液少許，與已熔化並冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻後，傾入滅過菌的培養皿中，待瓊脂凝固後，製成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時間即可出現菌落。如果稀釋得當，在平板表麵或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨後挑取該單個菌落，或重複以上操作數次，便可得到純培養。
由於將含菌材料先加到還較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，而且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中更常用的純種分離方法是塗布平板法。其做法是先將已熔化的培養基倒入無菌平皿，製成無菌平板，冷卻凝固後，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表麵，再用無菌玻璃塗棒將菌液均勻分散至整個平板表麵，經培養後挑取單個菌落（圖2-4）。
用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表麵進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線（圖2-5），微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少，並逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養後，可在平板表麵得到單菌落。
4. 稀釋搖管法（dilution shake culture method）
用固體培養基分離嚴格厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生物暴露於空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法製備平板，然後置放在封閉的容器中培養，容器中的氧氣可采用化學、物理或生物的方法清除。對於那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的分離則可采用稀釋搖管培養法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式* 。先將一係列盛無菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂熔化後冷卻並保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝後，在瓊脂柱表麵傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養基和空氣隔開。培養後，菌落形成在瓊脂柱的中間（圖2-6）。進行單菌落的挑取和移植，需先用一隻滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一隻毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。
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