1、腺病毒的一般特性
腺病毒的形態是特征性的二十麵體病毒殼體（Stewart et al., 1993）。其病毒殼體含有三種主要的蛋白：六鄰體（II），五鄰體基底（III）和纖突（IV），還有多種其他的輔助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2（Fig. 1）。腺病毒基因組是一個線性的雙鏈DNA，其5’端與一種末端蛋白（TP）共價結合（Rekosh et al., 1977），5’端上還具有末端反向重複序列（ITRs）。病毒DNA與核心蛋白VII和一個稱為mu的小肽緊密結合（Anderson et al., 1989）。另一種蛋白V包被在DNA-蛋白複合物上，並且通過蛋白VI為DNA-蛋白複合物和病毒殼體間提供了結構上的聯係（Matthews & Russell, 1995）。病毒含有一種病毒自身編碼的蛋白酶（Weber, 1976; Webster et al., 1989），這種蛋白酶對於加工某些結構蛋白從而產生成熟的具有感染性的病毒是必需的。
腺病毒家族（Adenoviridae）的成員可感染種類相當廣泛的有絲分裂後細胞，甚至包括來自高度分化的組織中的細胞，例如骨骼肌細胞，肺細胞，腦細胞和心髒細胞。因為腺病毒可將自身的基因組遞送到細胞核中，並且高效率地複製，所以腺病毒成為表達和傳遞治療基因的主要候選者。腺病毒的宿主範圍很寬，目前可將之分為三個屬，進一步可分為6個種（或稱為亞屬或亞群），編號從A到F。主要基於免疫學標準的人血清型的劃分，已經由於曆史原因而成為腺病毒分類的基礎（Benkö et al., 1999; Lukashok & Horwitz, 1998; Mautner, 1989）。有些腺病毒在動物體內可致瘤，在體外能轉化細胞，此處未列出相關文獻。
2、腺病毒載體的應用
腺病毒載體可高效地傳遞和表達基因的能力（尤其是在體外），在過去的15年裏已經得到充分地證實和記載。然而，體內的免疫反應限製了腺病毒載體的實際應用和發展。因此，在要求轉基因持續表達以彌補缺損基因活性的病例中，非常關鍵的一點就是控製或抑製針對病毒載體和轉基因的免疫反應。相反的，癌症治療卻可因活躍的免疫反應的誘導產生而增加療效。隨著人們對於生物分子和免疫因子在體內作用過程的理解逐漸加深，在過去的幾年裏，人們已經在構建更有效的載體方麵取得了大跨步的發展，這裏將會描述其中的一些方麵。
3、癌症的基因治療
在多個病例中，根據腫瘤的類型和分布，采用了多種技術來抑製和消除腫瘤細胞。大部分的載體是通過體外腫瘤模型而研製出來的，並且在適宜的動物模型上接受了檢測，其中有些動物模型是通過腫瘤移植方法而建立的。現在，這些途徑中有許多已經應用到了臨床試驗中。正在使用中的治療方法可分為三類：（i）腫瘤抑製基因或腫瘤消除基因，（ii）可溶解腫瘤和增強藥物敏感性的治療，（iii）疫苗。
（i）腫瘤抑製/消除基因。由於突變而造成功能喪失的p53基因與許多種人類腫瘤的形成相關（Wills et al., 1994）。為了治療這種缺陷並誘導腫瘤細胞的凋亡，已構建了多種攜帶野生型p53基因的載體。在開始的研究中，通過適當的腫瘤細胞係及爾後的動物模型係統，證明了這些途徑對於退行發育的甲狀腺癌（Blagosklonny et al., 1998）、人惡性神經膠質瘤（Cirielli et al., 1999; Li et al., 1999 a）和乳腺癌（Putzer et al., 1998）治療的有效性。在有些病例中，載體與某種免疫調節基因如IL-2（Putzer et al., 1998）或與某種細胞毒性藥物如阿黴素（Blagosklonny et al., 1998）結合使用，療效更為顯著。檢測這些載體對於肺癌、頭部癌，頸癌和肝癌的療效的臨床試驗正在進行中。然而，這種治療途徑固有的問題之一是載體有效的靶向性，而經由肝動脈直接注射來治療肝癌的方法已在一個小鼠模型上經過了試驗（Anderson et al., 1998）。最新的研究引人注目地顯示了ARF-mdm2-p53的交互作用在調節p53基因表達的過程中的重要性，而在多種腫瘤中發現的ARF和相關的轉錄因子如Twist（Maestro et al., 1999）的一係列突變（Eischen et al., 1999; Sanchez-Cespedes et al., 1999; Taniguchi et al., 1999）暗示了表達p53作用途徑中的其他成分的載體可能也可以達到同樣的療效。其他誘導凋亡的途徑也已得到探索，而這些途徑涉及到對於細胞周期非常關鍵的細胞周期蛋白依賴性的激酶。實際上，其中一種激酶p16已經在多種人類腫瘤細胞係中顯示出有缺損，而表達p21、p15和p16的載體也已在腫瘤模型係統中顯示出有效治療的希望（Tsao et al., 1999）。表達前凋亡蛋白如Fas配體和caspase-8的載體的使用卻因載體生產方法存在困難而受到限製。但是，最近所構建的表達腺病毒E3 14.7K蛋白或表達痘病毒serpin基因Crm.A的互補細胞係已提供了良好的生產和探索這些病毒載體的特性的途徑（Bruder et al., 2000）。另一種促進細胞凋亡的令人感興趣的途徑是核酶的使用，例如用抗H-ras的核酶治療膀胱癌（Irie et al., 1999），用抗Bcl-2的核酶治療前列腺癌（Dorai et al., 1999），以及用抗HER2的核酶治療乳腺癌（Suzuki et al., 2000）。
（ii）可溶解腫瘤和增強藥物敏感性的治療。20世紀50年代發現了野生型腺病毒之後不久，就嚐試了將野生型腺病毒直接注入腫瘤內，但隻顯示出局部的療效。然後直到1996年才有人宣稱，帶有E1B 55k基因突變的腺病毒可選擇性地在p53缺陷的腫瘤細胞中複製（Bischoff et al., 1996），因此可以作為溶解腫瘤的病毒來發揮作用。這導致了該種突變體（Onyx 015）的商業化發展。而且，雖然有很多文獻令人信服地說明原先的前提沒有持續下去（Hay et al., 1999 a; Ridgway et al., 1997; Vollmer et al., 1999），但仍然聲稱靜脈注射這種病毒可以有效地治療某些腫瘤（Heise et al., 1999）。與標準的化療相結合看起來也很有希望（Heise et al., 1997），用Onyx治療頭頸部癌的III期臨床試驗正在進行中。另外，最近的一項研究同時使用了E1B缺失的腺病毒和表達IL-2的腺病毒載體，在一個鼠模型中使p53缺陷導致的胰腺癌完全消退了（Motoi et al., 2000）。
研製出來的另一種選擇性地消除腫瘤細胞的策略是通過載體將一種前體藥物酶遞送到靶細胞中，然後注射一種非毒性藥物，這種藥物可在原位轉變成一種細胞毒素劑（Crystal, 1999）。單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）被廣泛地作為所謂的自殺基因來使用，因為注射9-1;3-二羥-2-丙氧甲基鳥嘌呤之後，該藥物將被HSV-tk磷酸化，從而釋放出DNA合成的鏈終止因子。這一技術已經用於頭頸部癌的原位治療（Goebel et al., 1998），並且完成了惡性間皮瘤（Sterman et al., 1998）和前列腺癌（Herman et al., 1999）治療的I期臨床試驗。同時缺失E1和E4區的病毒載體最近已構建出來，用於傳遞HSV-tk基因（Lanuti et al., 1999），顯然此種載體效果更好。胞嘧啶脫氨酶（CD）也作為自殺基因用於治療結腸癌，以腺病毒為載體，並且同時注射5-氟胞嘧啶（Hirschowitz et al., 1995）。HSV-tk和CD基因的融合基因也被插入到載體中用於治療前列腺癌（Blackburn et al., 1999）。一種含有三種形式的療法，即涉及到含有HSV-tk和CD雙自殺基因載體結合放療的療法，以證明對於一個宮頸癌異種移植物的腫瘤消減非常有效（Rogulski et al., 2000）。另一個令人感興趣的途徑是與CD載體共注射一種含有尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶基因的載體。在一個大鼠腫瘤模型中，這一途徑極大地增加了係統的敏感性（Adachi et al., 2000）。這些療法還伴隨出現了所謂的“旁觀者效應”，增強了細胞毒效應（Zhang & DeGroot, 2000）。
遞送各種細胞因子的載體可以補助含有自殺基因的載體的作用，從而增強原位的細胞毒性（Cao et al., 1998）。
在所有的這些係統中，很明顯的一點是，如果靶向性更高，療效將會大大增加；組織特異的啟動子可以整合進入載體中以促進這一點的實現（Hart, 1996）。已有報道這一技術在乳腺癌（Manome et al., 1994）、肝癌（Kaneko et al., 1995）和黑色素瘤（Siders et al., 1998 a）治療中的應用。然而，雖然在體內已經實現了目標的特異性，但結果經常令人失望，因為啟動子的活性相當低。一個試圖改善這一不足的嚐試采用了一種精巧的策略，該實驗在一個動物模型中使用了Cre-lox係統（補體受體增強作用-液氧係統）和一個腫瘤特異性抗原，由此獲得了很有希望的結果（Kijima et al., 1999）。
還應該列出關於在載體中保留E1A基因的重要性的文獻，因為在這些病例中，這種載體能夠促進P53轉錄，同時提高腫瘤細胞對細胞毒性試劑（Brader et al., 1997; Cook et al., 1999; Wildner et al., 1999）和對放療（Martin-Duque et al., 1999）的敏感性。
（iii）疫苗。對於激活抗腫瘤細胞免疫的策略已經通過載體的使用進行了探索。在這些嚐試中，多種免疫調節基因和/或腫瘤特異抗原基因通過載體導入體內。許多細胞因子可以以這種方式發揮作用：如此，IL-2能夠誘導CTLs，促進NK細胞的活性，並促使腫瘤浸潤淋巴細胞的成熟；高劑量的重組IL-2和IL-2表達載體成功地消減了動物模型中的腫瘤。然而，毒性問題變得突出起來（Toloza et al., 1996），後麵的研究便集中於對其他細胞因子更為定向的遞送，包括IL-12（Bramson et al., 1996; Gambotto et al., 1999; Mazzolini et al., 2000; Siders et al., 1998 b），有時候是與IL-2（Addison et al., 1998）和腫瘤抗原（Hirschowitz & Crystal, 1999）結合使用。將表達IL-2或IL-12的載體與表達淋巴細胞激活素（lymphotactin）的載體組合進行瘤內注射，在小鼠的乳腺癌模型係統中取得了成功（Emtage et al., 1999）。意識到多種腫瘤會呈現腫瘤特異抗原這一點，激發了表達這些抗原的載體的使用，這類載體可以發揮促進抗腫瘤免疫反應的作用；由此進行了用表達MART 1或gp100的腺病毒載體治療轉移性黑色素瘤的試驗（Rosenberg et al., 1998）。這些結果證實了高劑量腺病毒載體的注射給藥是安全的，但是針對載體出現的免疫反應卻消除了長期的抗腫瘤效應。在一個結腸癌模型係統中（Li et al., 1997），通過腺病毒載體表達的腫瘤抗原使腫瘤出現了明顯地消減，並誘導了進一步的針對腫瘤的免疫反應。另一個前景很好的增強抗腫瘤免疫反應的途徑是根據體內樹突狀細胞具有有效呈現抗原的能力。有人建議，一個有效的策略將是從病人體內分離出樹突狀細胞，用表達適當的腫瘤抗原的腺病毒載體來感染，將之改造並回輸到病人體內，同時結合標準的療法（Crystal, 1999）。對人樹突狀細胞的研究顯示，用腺病毒載體改造的樹突狀細胞其成熟度和功能不會受到影響（Rea et al., 1999; Zhong et al., 1999），轉移性肺癌的明顯消減已經由鼠的樹突狀細胞而獲得（Wan et al., 1999）。一個黑色素瘤的鼠樹突狀細胞模型也通過腺病毒載體顯示出顯著的抗黑色素瘤免疫反應的增強（Tuting et al., 1999）。使用雙特異性抗體使病毒再定位於細胞表麵的CD40受體上可以大幅度提高載體對樹突狀細胞的靶向特異性（Tillman et al., 1999）。這一技術亦促進了細胞的成熟，因此增強了它們的免疫激活特性。表達CD40配體的載體可以直接導入腫瘤細胞內，並且在動物模型中促進了抗原呈遞能力，使腫瘤消減（Kikuchi & Crystal, 1999）。相關的其他策略涉及到粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的載體表達（Ozawa et al., 1999），以及增強樹突狀細胞對編碼TGF 1（腫瘤生長因子 1）的載體的耐受性（Lee et al., 1999 b）。最近的研究顯示，樹突狀細胞可以用與其自身CAR狀態無關的載體來感染，而且這些細胞可以呈現出適當的CTL（腫瘤特異性殺傷T淋巴細胞）效應（Linette et al., 2000）。
4、遺傳疾病的基因治療
囊性纖維化是一種相對普通的隱性遺傳疾病，由CFTR基因突變造成，導致氯離子傳導性降低，鈉離子吸收率升高。由於這種缺陷在肺裏表現得很明顯，因此對肺有親嗜性的腺病毒成為可選擇的遞送該疾病治療基因的載體之一。然而，多種研究顯示要成功地實現轉基因表達還有很多障礙，其中之一是標準的Ad2/5載體不能感染高度分化的導氣管上皮細胞和肺泡巨噬細胞，這主要是由於CARs的缺乏（Kaner et al., 1999; Pickles et al., 1998; Walters et al., 1999）。已嚐試過用陽離子脂質體和磷酸鈣共沉澱的方法來提高病毒的感染率（Alton et al., 1999; Fasbender et al., 1997, 1998; Lee et al., 1999 a）。一個更有希望的途徑是構建帶有Ad17（血清型）纖突的腺病毒嵌合體，這種方法提高了腺病毒與導氣管上皮細胞的結合力（Zabner et al., 1999）。阻礙轉基因成功表達的另一個障礙是特異的肺相關T輔助細胞效應（van Ginkel et al., 1997），新近的研究則顯示了載體中E4基因的保留對於抵消這種襲擊效應的重要性（Armentano et al., 1997; Chirmule et al., 1998; Lusky et al., 1999; Yew et al., 1999）。更深一層的、天然的障礙是導氣管上皮細胞可釋放出具有抗腺病毒特性的抗菌多肽（Gropp et al., 1999），而且，對支氣管肺泡灌注液的研究顯示除了中和性抗體外，還存在著腺病毒抑製因子（Bastian & Bewig, 1999）。許多的這些因子可能可以解釋早期腺病毒載體用於臨床試驗的結果，即，雖然轉導效率得到證實，但整體的效率還是很低，轉基因的表達時間相當短（Zuckerman et al., 1999）。今後的載體能否提高轉基因的表達效率和持續時間還有待於觀察。
為了修複導致肌肉萎縮症的基因缺陷，大量地嚐試了腺病毒載體的使用。在一個小鼠模型係統中，編碼營養障礙基因（dystrophin）的載體可以遞送到肌肉纖維中，使肌肉功能出現了一定程度的改善，但這隻是暫時的，因為出現了抗載體和轉基因的嚴重免疫反應（Yang et al., 1998; Yuasa et al., 1998）。為了克服這一點而采取的措施包括使用改良的載體（Kumar-Singh & Chamberlain, 1996）和使用utrophin（dystrophin的同係物）（Gilbert et al., 1999），這些嚐試顯示出了較好的轉基因持久性。阻礙基因有效轉導的障礙之一與細胞上缺乏所使用載體的受體相關，而帶有多聚賴氨酸修飾的纖突的載體顯著地促進了肌肉細胞對病毒載體的攝取（Bouri et al., 1999）。已知肌肉纖維細胞中的免疫反應是由樹突狀細胞介導的，同時暗示AAV載體可能是遞送轉基因的更好的載體（Jooss et al., 1998 c）。一個犬模型係統也顯示出免疫反應的重要影響，因為用腺病毒遞送了dystrophin基因後再用環孢菌素治療得到了更為持久的肌肉功能的改善（Howell et al., 1998）。
已經構建了許多載體以減輕其他組織中的基因缺陷，在基因遞送方麵也遇到了類似的問題。
5、其他療法
隨著高齡人口的增加，對於人神經退化疾病如帕金森氏病的治療提出了一個重要的挑戰。腺病毒，因其可以感染有絲分裂後的細胞，同時具有潛在的高轉導效率和在中樞神經係統免疫特惠區（immunologically privileged site）中的低病原性，因此是進行神經疾病基因治療的有效載體。已試驗了兩種傳遞治療基因的主要策略。一個涉及到載體的腦內直接注射，另一個則是采用取出體內細胞在體外經由載體感染修飾後回輸腦內相關區域的基因療法（ex vivo基因療法）（Barkats et al., 1998）。神經母細胞（neuroprogenitor）（Fisher, 1997）和人星型膠質細胞（Ridet et al., 1999）明顯可以作為自體同源的細胞載體用於ex vivo修飾和擴張（expansion）。使用四環素調節的腺病毒載體來表達酪氨酸羥基化酶（多巴胺合成途徑中的限速酶）在若幹動物模型中用ex vivo技術表現出了可觀的前景（Corti et al., 1999 a, b）。在一次嚐試用腺病毒緩解亨廷頓疾病的過程中，發現表達腦衍生神經營養因子（BDNF）的構建物在一個大鼠模型中顯示出了令人充滿希望的結果（Bemelmans et al., 1999）。還有文獻報道在腺病毒構建物中使用神經沉默基因成分來限製神經細胞內基因的表達（Reference has been made above to the use of neuronal silencer elements I adenovirus constructs in restricting expression to neuronal cells），這樣做是期望這一策略能夠避免轉基因異位表達造成的副作用（Millecamps et al., 1999）。
在過去的幾年中，我們對於關節炎和細胞因子刺激炎症反應在關節和滑膜液中出現的過程有了更深的理解。一個主要的發現是TNF（腫瘤壞死因子）在誘導類關節炎">關節炎過程中所扮演的角色，由TNF抗體（Maini et al., 1999）和TNF受體（Franklin, 1999）成功進行了臨床試驗充分地說明了這一點。腺病毒載體在闡明某些細胞因子在這種疾病過程中的重要性和作用途徑方麵非常有用。如此，用腺病毒載體直接遞送TNF受體和細胞因子IL-1在一個大鼠模型中在注射部位和遠端部位都顯示出了協同效應（Ghivizzani et al., 1998）。類似的，在一個動物模型中，TNF受體與表達IL-10的EB病毒顯示出顯著的協同效應（Kim et al., 2000; Lechman et al., 1999）。表達IL-4載體的使用證明這種細胞因子能為軟骨提供相當重要的保護以免發生炎症反應（Lubberts et al., 1999）。相反的，IL-12通過載體的遞送卻加速了疾病的進程（Parks et al., 1998）。通過觀察獲得了重要的進展，即NF-B抑製物的載體表達抑製了巨噬細胞中TNF的產生（Foxwell et al., 1998），而新近的研究顯示NF-B的抑製作用伴隨著致炎細胞因子的抑製作用，而不是伴隨著主要的炎症介導物如IL-10的抑製（Bondeson et al., 1999 a, b）。這些結果由此精確地說明了NF-B在炎症中的重要作用，並指明了一個治療的目標。然而，應該指出的是，TNF的產生在某些細胞如單核細胞中並非依賴於NF-B（Hayes et al., 1999）。
6、其他用途
腺病毒在生產多種蛋白以進行更為詳細的分子間的作用分析方麵是非常有用的載體，關於這一點，讀者可以參見Hitt et al. 所作的非常全麵的綜述（1997）。在美國軍隊中出現腺病毒引起的呼吸道疾病之後，腺病毒疫苗已經徹底地檢查了其安全性（Chanock et al., 1966），這促進了針對人免疫缺陷病毒（Bruce et al., 1999）和狂犬病病毒（Matthews et al., 1999; Yarosh et al., 1996）的重組腺病毒疫苗的研製發展。現有一篇對早期疫苗發展過程的綜合性評述（Graham & Prevec, 1992）。
上一篇：Hirt法快速提取腺病毒DNA
下一篇：噬菌體培養法
