氨金黃敏顆粒微生物限度檢查方法的驗證

【摘要】  目的  驗證氨金黃敏顆粒的微生物限度檢查方法是否適用於該供試品的檢查。方法  細菌計數采用低速離心—培養基稀釋法，黴菌及酵母菌計數按常規檢查法，控製菌按常規檢查法。結果  稀釋劑對照組的菌回收率大於70%，試驗組的菌回收率大於70%；陰性對照組未檢出陰性對照菌，試驗組檢出陽性試驗菌。結論  可以用該微生物限度檢查法進行氨金黃敏顆粒的檢查。
【關鍵詞】  氨金黃敏顆粒  微生物限度檢查法  驗證
        氨金黃敏顆粒的微生物限度檢查法本公司以前采用常規法，為了保證檢驗方法的科學性，現對本公司生產的氨金黃敏顆粒的微生物限度檢查方法進行方法學驗證，驗證此方法是否適用於該供試品的檢查。
        1  材料與儀器
        1.1 試驗樣品  藥品名稱：氨金黃敏顆粒，批號：090901、090902、090903，來源：公司自產。
        1.2 驗證用儀器
        1.2.1 電熱恒溫幹燥箱、電冰箱、電熱恒溫培養箱、恒溫水浴鍋、離心機、蒸汽滅菌鍋、集菌儀等。
        1.2.2 玻璃器皿  錐形瓶、培養皿、量筒、試管、吸管等。
        1.3 驗證用菌種  金黃色葡萄球菌；大腸埃希菌；枯草芽孢杆菌；白色念珠菌；黑曲黴。
        1.4 驗證用培養基及稀釋劑  營養瓊脂培養基；玫瑰紅鈉瓊脂培養基；膽鹽乳糖培養基；營養肉湯培養基；改良馬丁培養基；曙紅亞甲藍瓊脂培養基。
        2  驗證條件
        無菌室環境潔淨度為10000級，局部潔淨度為100級，淨化消毒30min以上，供試品及滅菌的器具等經傳遞窗紫外殺菌燈照射30min置無菌室內，試驗人員手消毒後穿無菌服進入操作間。
        3  方法與結果
        3.1 菌液製備  接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鮮斜麵培養物接種於營養肉湯培養基中，於35℃培養18～24小時，分別取各菌種培養液1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml中，10倍依次稀釋，金黃色葡萄球菌稀釋至10-5，大腸埃希菌稀釋至10-7，枯草芽孢杆菌稀釋至10-5， 約為50～100cfu/ml,備用。
        接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，於23～28℃培養23～48小時，取培養液1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml中，10倍依次稀釋至10-5，約為50～100cfu/ml,備用。
        取黑曲黴的新鮮斜麵培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液5ml將孢子洗下，吸取此溶液1ml置一個無菌的比色管中，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量與標準比濁管進行比濁，取比濁後的菌懸液1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml中，10倍依次稀釋至10-4，約為50～100cfu/ml，備用。      

        3.2 供試液製備  取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml，用勻漿儀分散混勻，作為1∶10的供試液。
        3.3 細菌、黴菌及酵母菌計數驗證試驗
        3.3.1 試驗組  細菌計數采用低速離心—培養基稀釋法，取1∶10供試液10ml，500轉/分離心5分鍾，取全部上清液，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液補足至原量，混勻，再從中取1ml分別加入5個平皿中（每皿0.2ml），加入各陽性細菌試驗菌1ml，立即傾注相應的瓊脂培養基，置32℃恒溫培養箱中培養48h，測定細菌數。黴菌及酵母菌計數采用常規法，取1∶10供試液1ml，加入各黴菌及酵母菌試驗菌1ml，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置25℃恒溫培養箱中培養72h，測定黴菌及酵母菌數。
        3.3.2 菌液組  取稀釋好的各菌液1ml，分別加入平皿中，加入相應培養基，置規定條件培養，測定所加的試驗菌數。
        3.3.3 供試品對照組  按試驗組方法，測定供試品本底菌數。
        3.3.4 稀釋劑對照組  取稀釋劑替代供試液，方法同試驗組。
        試驗組菌回收率（%）={（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液組平均菌落數}×100%
稀釋劑對照組菌回收率（%）=（稀釋劑對照組平均菌落數/菌液組平均菌落數）×100%
        3.4 控製菌檢查方法的驗證
        3.4.1試驗組  取1∶10的供試液10ml，置無菌條件下離心（500轉/分）5分鍾，取上清液置無菌試管中，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液補足至原量，混勻，加至膽鹽乳糖培養基100ml中，再加陽性對照菌大腸埃希菌菌液1ml，搖勻，置35～37℃恒溫培養箱中培養18～24小時。大腸埃希菌濃度同細菌、黴菌及酵母菌數驗證。
        3.4.2陰性對照組  方法同試驗組，加入1ml陰性菌（即金黃色葡萄球菌，濃度同細菌、黴菌及酵母菌數驗證），置35～37℃恒溫培養箱中培養18～24小時。
        3.5結果分析
        3.5.1細菌、黴菌及酵母菌計數驗證結論  在三次試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率均大於70%，試驗組的菌回收率均大於70%，故可照供試液製備方法和計數法測定氨金黃敏顆粒的細菌、黴菌及酵母菌數。
        3.5.2控製菌驗證結論  在三次試驗中，陰性對照組未檢出陰性對照菌，試驗組檢出陽性試驗菌，故可用此供試液製備法和控製菌檢查法進行氨金黃敏顆粒的控製菌檢查。
        4  討論
        4.1 許多藥品本身的特性（如抑菌性）會對檢驗結果帶來影響，需要對供試品進行適當的預處理，以消除其本身帶來的幹擾。
        4.2 藥品的微生物檢查是保證藥品使用安全的重要檢查項目，必須對每個品種的檢驗方法進行驗證。
        4.3 試驗過程中，應嚴格遵守操作規範，保證結果的可靠性。 
        參 考 文 獻 
        [1]中華人民共和國藥典(2010版)二部：附錄107.
        [2]中國藥品檢驗標準操作規程（2010版）：351.
        [3]張冬，王蘭卿.化學藥品衛生質量考察及微生物限度檢查法探討[J].現代應用藥學,1997,14(1):44.

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