克黴唑（Clotrimazole）藥膜作為陰道局部外用製劑，中國藥典2005（CP2005）年版二部對受微生物汙染的微生物限度有明確要求，對具有抗菌活性的藥品進行微生物限度檢查，首先應排除抗菌活性，經驗證試驗來確認其抑菌活性是否去除而不影響檢驗結果，保證檢驗結果的準確性。2007年11月~2008年2月為建立克黴唑藥膜微生物限度檢查方法，參考中國藥典，以試驗菌的回收測定為主要方法，測定克黴唑膜製劑在微生物限度檢查條件下對細菌、黴菌、酵母菌的代表菌的抑菌活性，並進行方法選擇試驗［1，2］；對篩選出的敏感菌選擇用離心沉澱與薄膜過濾法聯用消除其抑菌活性，經選擇試驗確定供試液濃度及衝洗條件，按篩選出的方法作3個批號計數方法的驗證，對方法進行評價［3］；對控製菌檢查方法進行了驗證試驗研究，建立克黴唑藥膜的微生物限度檢查方法。
1 實驗材料及儀器
1.1 儀器與樣品
ＨＴＹ-2000型智能集菌儀、多次使用集菌器、一次性薄膜過濾器（杭州泰林生物技術設備有限公司）、離心機（800型沉澱離心機，上海手術器械十廠）、高壓蒸汽滅菌器、電子天平、生物安全櫃、生化培養箱等。克黴唑藥膜 （ 規格：4mg，貴州德軒堂製藥有限公司生產批號：051225、051226、051227）。
1.2 培養基、稀釋劑及試劑
營養瓊脂、營養肉湯、玫瑰紅鈉瓊脂、改良馬丁培養基、膽鹽乳糖增菌培養基、溴化十六烷基三甲胺瓊脂、亞碲酸鹽肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂、0.9%氯化鈉溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液（中國北京三科科技開發公司生產，按CP2005版規定配製及滅菌）［1］。
1.3 試驗用菌種
大腸埃希菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylocoddus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、白色念珠菌Candida aibicans、黑曲黴Aspergillus niger、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC（B）10104]，菌種均來源於中國醫學細菌保存中心，均為不超過5代的菌株［1］。
2 方法
參照CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法中計數方法的驗證、控製菌檢查方法的驗證。
2.1 菌液製備方法
取經（36±1）℃培養16~18 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌肉湯新鮮培養液，加入0.9%氯化鈉溶液或營養肉湯，10倍遞增稀釋製成50~100 cfu/ml菌液，計數備用。取經26 ℃培養24~48 h的白色念珠菌的改良馬丁液體新鮮培養液，用0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋製成50~100 cfu/ml菌液計數，備用。取經26 ℃培養5~7 d的黑曲黴改良馬丁斜麵培養物，加適量0.9%氯化鈉溶液洗下孢子，取孢子懸液加入0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋製成50~100 cfu/ml孢子懸液計數，備用。
2.2 供試液製備方法
取樣品100 cm2，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液100 ml，振搖，使充分分散均勻，即為1∶10供試液； 取上述1∶10供試液10 ml加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液分別至50、100、200 ml，即為1∶50、1∶100、1∶200供試液。
2.3 敏感菌的確定及細菌、黴菌、酵母菌計數方法選擇試驗及驗證試驗方法
為確定克黴唑藥膜的敏感菌，選擇有效的去除抑菌活性的方法，用CP2005年版平皿稀釋法、低速離心沉澱處理供試液與平皿稀釋法聯用、低速離心沉澱處理供試液與薄膜過濾法聯用消除其抑菌活性［1，2］；對試驗菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲黴進行活菌計數回收試驗，從各菌的回收結果確定敏感菌，選擇出回收率在70%以上的方法作為有效方法，各試驗菌作3個批號驗證試驗以對方法進行評價。
2.3.1 平皿稀釋法［1］ 每皿中分別加入1∶10供試液1 ml、0.2 ml，每皿分別各加入試驗菌50~100 cfu，立即傾注規定的瓊脂培養基15~20 ml，每種試驗菌平行製備2個皿，置規定溫度，培養、計數菌落數作為試驗組；不加入供試液，同法測定相應加入的試驗菌數，作為菌液組；不加入試驗菌，同法測定1∶10供試液1 ml、0.2 ml中的本底菌數作為空白組，計算回收率。回收率（%）=[(試驗組平均菌落數-空白組平均菌落數)÷菌液組平均菌落數]×100%。
2.3.2 離心加薄膜過濾法聯用 取供試液10 ml於500 r/min離心4~5 min，管底離心沉澱物0.25 ml，取出全部上層液混勻，即為供試液，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液（衝洗液室溫或加熱至40~45 ℃）約90 ml中，混勻過濾衝洗，在最後一次衝洗夜中加入試驗菌。取膜貼於規定的瓊脂培養基，作為試驗組，培養、計數菌落數［1］；在衝洗液中加入與試驗組等量試驗菌液，過濾，取膜貼於規定的瓊脂培養基作為菌液組；不加入試驗菌，同法測定供試液中的本底菌數，作為空白對照；計算回收率（同平皿稀釋法）。
2.3.3 衝洗方法條件選擇 采用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液衝洗，每個濾器60、80~90 ml/次，衝洗量 300 ml、500 ml或800 ml，在最後一次衝洗液中加試驗菌液，衝洗液溫度為室溫、40~45 ℃，按衝洗效果進行選擇。
2.4 控製菌檢查驗證試驗
2.4.1 銅綠假單胞菌 取1∶10供試液10 ml，按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法中銅綠假單胞菌規定的相應方法進行驗證。
2.4.2 金黃色葡萄球菌 取1∶10供試液10 ml 500 r/min，離心5 min，取全部上清液加至裝有約80 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液的濾器中按薄膜過濾法過濾，衝洗3次，100 ml/次，取膜加至相應的增菌培養基100 ml中，以下操作按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法中金黃色葡萄球菌檢查的相應方法進行驗證。
3 結果
3.1 敏感菌確定及細菌、黴菌及酵母菌計數方法選擇試驗
大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲黴、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌用平皿稀釋法1∶10供試液，每皿1 ml，前3種細菌的回收率分別為97%、65%、89%，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌無回收，大腸埃希菌、黑曲黴回收率均達到70%以上；每皿0.2 ml金黃色葡萄球菌回收率為118%；枯草芽孢杆菌、白色念珠菌也無回收，因此確定為敏感菌。用低速離心沉澱處理供試液與薄膜過濾法聯用消除克黴唑抑菌活性，枯草芽孢杆菌500 r/ min離心5 min，薄膜過濾，衝洗300 ml，取供試液10 ml（濃度1∶10、1∶100、1∶200），回收率分別為0、52%、95%，1∶200可達70%以上；白色念珠菌500 r/ min離心4 min，薄膜過濾。結果見表1。表1 敏感菌確定及消除抑菌活性方法選擇試驗結果（回收率%）
3.2 驗證試驗結果
3.2.1 大腸埃希菌、黑曲黴、金黃色葡萄球菌驗證結果 前2種試驗菌采用平皿法，每皿加入1∶10供試液1 ml；金黃色葡萄球菌用平皿稀釋法，每皿加入1∶10供試液0.2 ml，作3個批號樣品回收試驗，結果見表2。
3.2.2 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌驗證結果
根據方法選擇結果，枯草芽孢杆菌驗證方法采用離心沉澱處理供試液與薄膜過濾法聯用，取1∶200供試液10 ml，500 r/min離心5 min，取全部上清液 表2 大腸埃希菌、黑曲黴、金黃色葡萄球菌驗證試驗結果(cfu) 注：空白組均為o cfu
加入約90 ml衝洗液中，過濾，60 ml/次衝洗5次，共300 ml，作3個批號樣品，結果見表3。
白色念珠菌驗證：根據選擇結果，離心沉澱處理供試液，用薄膜過濾，衝洗液溫度提高至40~45 ℃，衝洗，上清液0.25 ml、0.2 ml衝洗500 ml，回收均能達70%以上。取1∶10供試液10 ml，500 r/min,離心4 min，全部上清液混勻，取0.25 ml過濾，40~45 ℃衝洗液每次80~90 ml衝洗6次，共 500 ml，3個批號樣品分別作回收試驗，平行作2個 膜，結果見表3。 表3 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌離心加薄膜濾法驗證試驗結果注：空白組均為o cfu
3.2.3 稀釋劑對照組 由於2種敏感菌計數方法采用離心、薄膜過濾、衝洗，為考察供試液中微生物受影響的程度，作稀釋劑對照組回收試驗。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液加入試驗菌，濃度為50~100 cfu/10 ml；取10 ml與試驗組同法離心加薄膜過濾、衝洗，取膜貼於規定的瓊脂培養基，測定菌數，為試驗組；不作離心加薄膜過濾、衝洗為菌液組，計算回收率，結果均能達到70%以上。
3.2.4 控製菌檢查驗證試驗 結果見表4。表4 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌驗證試驗結果注：BL增菌液為100 ml；+：生長相應典型菌落或陽性反應； —：無菌生長或陰性反應
4 討論
4.1 克黴唑為抗真菌藥，按CP2005年版規定的驗證菌株為試驗菌分別作回收，從本組結果看出，平皿稀釋法白色念珠菌、枯草芽孢杆菌均無回收，離心加薄膜過濾法1∶10供試液無回收、1∶50為8%，藥物對真菌白色念珠菌有很強抗菌活性，對細菌枯草芽孢杆菌也顯示較強抗菌作用，即克黴唑藥膜抗真菌的敏感菌為白色念珠菌敏感菌、細菌為枯草芽孢杆菌。藥物對大腸埃希菌、黑曲黴（采用平皿法）均未顯示有抑菌活性，試驗中金黃色葡萄球菌采用平皿稀釋法回收率均大於70%，顯示有一定抑菌活性。
4.2 為消除藥物對敏感菌的抑菌活性，采用離心加與薄膜過濾法對2種敏感菌進行了方法條件的選擇。
白色念珠菌1∶10、1∶50供試液10 ml經500 r/min離心4 min，膜法衝洗300 ml，回收率為0%、8%；取上清液1 ml室溫衝洗300 ml、500 ml、800 ml，均無回收。
衝洗液溫度對白色念珠菌回收的影響：由於克黴唑難溶於水，膜法過濾衝洗液溫度較低時，藥物及輔料溶解不充分截留於膜上藥物不能衝洗幹淨，1∶10供試液上清液0.25 ml試驗結果無回收；將衝洗液溫度加熱提高至40~45 ℃衝洗，取上清液0.25 ml、0.2 ml衝洗500 ml回收率均能達70%以上；結合表3對3個批號樣品的驗證試驗結果，該法能有效消除藥物對白色念珠菌抗菌活性，回收率均能達70%以上，重現性好。
枯草芽孢杆菌1∶10、1∶100、1∶200 3種供試液試驗結果：前2種回收均達不到70%；1∶200供試液可消除其抑菌活性，回收率達70%以上；結合表3對3個批號樣品的驗證試驗結果，該法能有效消除藥物對枯草芽孢杆菌抗菌活性，回收率均能達70%以上。
4.3 稀釋劑對照組結果：與試驗組同法，白色念珠菌、枯草芽孢杆菌在離心加薄膜過濾及衝洗條件下基本不受影響，回收率均能達到70%以上。
4.4 控製菌金黃色葡萄球菌檢查方法驗證：3個批號驗證試驗結果均能檢出金黃色葡萄球菌，陰性菌對照組結果顯示方法專屬性好（表4）；表4結果顯示銅綠假單胞菌檢查方法可按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法規定的方法檢查。
4.5 根據試驗研究的結果，建立克黴唑藥膜微生物限度檢查方法 細菌計數：取 1∶200的供試液10 ml於500 r/min離心5 min，取全部上清液加至裝有約90 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液中混勻，過濾，60 ml/次，衝洗5次，共300 ml；其它操作按CP2005年版二部微生物限度檢查法薄膜過濾法。黴菌、酵母菌計數：取 1∶10的供試液10 ml於500 r/min離心4 min，取出全部上清液混勻作為供試液，取 0.25 ml加至裝有約100 ml 45 ℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液中混勻，過濾，用45℃衝洗液衝洗6次，80~90 ml/次，共500 ml，作4個膜（取樣量共1 ml）；其它操作按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法薄膜過濾法。
計數結果計算：Ｘ=A×K。 Ｘ：菌數（cfu/10 cm2）；A細：營養瓊脂平板膜上的菌落數或菌落平均數 ；A黴菌、酵母菌：4個玫瑰紅鈉瓊脂平板膜上的菌落總數 ；K：稀釋倍數，K細=20，K黴、酵=10。
控製菌檢查：銅綠假單胞菌，取1∶10供試液10 ml，按CP2005年版二部微生物限度檢查法相應方法檢查；金黃色葡萄球菌，取1∶10供試液10 ml，500 r/min離心5 min,取全部上清液，加至裝有約90 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液的濾器中，過濾，衝洗3次，100 ml/次，取膜加至相應的增菌培養基100 ml中，以下操作按CP2005年版二部微生物限度檢查法中相應方法檢查。
以上建立的方法能有效的控製該藥品質量，可作為克黴唑藥膜的微生物限度檢查方法。
[1] 國家藥典委員會.中國藥典2005年版二部附錄[S].北京： 化學工業出版社， 2005：93.
[2] 中國藥品生物製品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規範[S].北京：中國醫藥科技出版社，2005：325.
[3] 劉鵬，馬仕洪.加替沙星微生物限度檢查方法的建立[J] .藥物分析雜誌，2007（6）：881-884.
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