【論文關鍵詞】土黴素片；微生物限度檢查法
【論文摘要】目的：建立土黴素片的微生物限度檢查方法。 方法：采用薄膜過濾法對土黴素片處理後，分別進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證。結果：金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率均大於70%。結論：土黴素片采用薄膜過濾法檢查微生物限度方法成立。
土黴素是四環素類抗生素，能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位結合，抑製肽鏈的增長和影響細菌蛋白質的合成，對細菌有廣譜抑菌作用。因此其微生物限度檢查不能用平皿法，而應采用薄膜過濾法消除其抑菌作用後再檢查。
1 材料
1.1 儀器：HWS-250型恒溫恒濕箱（天津蘇瑞科技開發有限公司），集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司），薄膜（孔徑0．22um），康氏振蕩器。
1.2 試劑：玫瑰紅鈉瓊脂培養基，營養瓊脂培養基，膽鹽乳糖增菌培養基，MUG培養基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基等，均由中國藥品生物製品檢定所提供。
1.3 菌種：陽性對照菌：金黃色葡萄球菌（驗證細菌）、白色念珠菌（驗證酵母菌、黴菌）；陰性對照：金黃色葡萄球菌（驗證大腸埃希菌）。所用菌種均由中國藥品生物製品檢定所提供；稀釋劑及衝洗劑為pH7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液。
1.4 樣品：土黴素片［0.25g（25萬單位）］，廠家為河南華利藥業有限責任公司，批號為07070601。
2 方法與結果
2.1 細菌、黴菌、酵母菌檢查方法驗證。
2.1.1 細菌檢測方法驗證。
2.1.1.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液，於康氏振蕩器上振搖10分鍾，使片分散，500轉、分離心後，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用衝洗液衝洗2次，每次100ml，第3次衝洗液中加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml，薄膜過濾，取出濾膜，麵朝上貼於營養瓊脂平皿上，35℃培養48小時，計數。
2.1.1.2 菌液組：取金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml,直接接種於營養瓊脂平皿上，35℃培養48小時，計數。
2.1.1.3 供試品對照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用衝洗液衝洗3次，每次100ml，取出濾膜，麵朝上貼於營養瓊脂平皿上，35℃培養48小時，計數。
2.1.1.4 稀釋劑對照組：取稀釋液10ml,薄膜過濾，用衝洗液衝洗2次，每次100ml,第3次衝洗液中加入0.5ml金黃色葡萄球菌菌懸液，薄膜過濾，取出濾膜，菌麵朝上貼於營養瓊脂平皿上，35℃培養48小時，計數。
2.1.1.5 上述試驗連續做三次，結果如下：
金黃色葡萄球菌計數後平均值：
稀釋劑對照組菌數：第一次47個，第二次53個，第三次49個；
菌液組菌數：第一次58個，第二次64個，第三次60個；
試驗組菌數：第一次45個，第二次54個，第三次46個；
供試品對照組菌數：第一次0個，第二次0個，第三次0個。
2.1.1.6 計算金黃色葡萄球菌回收率。
2.1.1.6.1 稀釋劑對照組的回收率:(稀釋劑對照組的平均菌落數/菌液組的平均菌落數)×100%
第一次：47/58×100%=81.0%
第二次: 53/64×100%=82.8%
第三次: 49/60×100%=81.7%
2.1.1.6.2 試驗組的回收率:
[(試驗組的平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數]×100%
第一次：（45-0）/58×100%=77.6%
第二次:（54-0）/64×100%=84.4%
第三次:（46-0）/60×100%=76.7%
2.1.2 黴菌、酵母菌檢查方法驗證。
2.1.2.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液，於康氏振蕩器上振搖10分鍾，使片分散，500轉、分離心後，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用衝洗液衝洗2次，每次100ml，第3次衝洗液中加入白色念珠菌菌懸液0.5ml，薄膜過濾，取出濾膜，麵朝上貼於營養瓊脂平皿上，23℃培養72小時，計數。
2.1.2.2 菌液組：取白色念珠菌菌懸液0.5ml,直接接種於營養瓊脂平皿上，23℃培養72小時，計數。
2.1.2.3 供試品對照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用衝洗液衝洗3次，每次100ml，取出濾膜，麵朝上貼於營養瓊脂平皿上，23℃培養72小時，計數。
2.1.2.4 稀釋劑對照組：取稀釋液10ml,薄膜過濾，用衝洗液衝洗2次，每次100ml,第三次衝洗液中加入0.5ml白色念珠菌菌懸液，薄膜過濾，取出濾膜，菌麵朝上貼於營養瓊脂平皿上，23℃培養72小時，計數。
2.1.2.5 上述試驗連續做三次，結果如下：
白色念珠菌計數後平均值：
稀釋劑對照組菌數：第一次56個，第二次60個，第三次53個；
菌液組菌數：第一次45個，第二次47個，第三次42個；
試驗組菌數：第一次43個，第二次45個，第三次44個；
供試品對照組菌數：第一次0個，第二次0個，第三次0個。
2.1.2.6 計算白色念珠菌的回收率。
2.1.2.6.1 稀釋劑對照組的回收率:
(稀釋劑對照組的平均菌落數/菌液組的平均菌落數)×100%
第一次：45/56×100%=80.4%
第二次: 47/60×100%=78.3%
第三次: 42/53×100%=78.2%
2.1.2.6.2 試驗組的回收率:
[(試驗組的平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數]×100%
第一次：（43-0）/56×100%=76.8%
第二次:（45-0）/60×100%=75.0%
第三次:（44-0）/53×100%=83.0%
2.2 大腸埃希菌檢測方法驗證。
2.2.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液，於康氏振蕩器上振搖10分鍾，使片分散，500轉/分離心後，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用衝洗液衝洗2次，每次100ml，第三次衝洗液中加入大腸埃希菌菌懸液0.2ml，薄膜過濾，取出濾膜，放入100ml膽鹽乳糖培養基中, 35℃培養24小時,取0.2ml上述培養物加入5ml MUG培養基中,24小時後,加靛基質試液5滴,液麵呈現玫瑰紅環。
2.2.2 陰性菌對照組：照上述方法操作，第三次衝洗時衝洗液中加入2ml金黃色葡萄球菌菌液，薄膜過濾，取出濾膜加入100ml膽鹽乳糖培養基中，於35℃培養24小時，再取上述培養物劃線接種於甘露醇氯化鈉瓊脂培養基的平板上，於35℃培養24小時，未發現有金黃色葡萄球菌典型菌落。
3 討論
3.1 在細菌、黴菌及酵母菌計數方法驗證三次平行試驗中，稀釋劑對照菌回收率均不低於70%，試驗組的菌回收率均不低於70%，照薄膜過濾法可進行土黴素片的細菌、黴菌及酵母菌的檢查。
3.2 通過大腸埃希菌檢測方法驗證，陰性對照組未檢出金黃色葡萄球菌，試驗組檢出大腸埃希菌，按薄膜過濾法可進行土黴素片的大腸埃希菌檢查。
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