微生物限度檢查法係檢查非規定滅菌製劑及其原料、輔料受微生物汙染程度的方法。檢查項目包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控製菌檢查［１］。我們采用常規方法對頭孢拉定膠囊進行微生物限度檢查時發現,不僅頭孢拉定本身對細菌的強抑製作用影響實驗結果，而且頭孢拉定膠囊的某些輔料也對微生物限度檢查法產生一定影響，不能有效地保證實驗結果的準確性。我們采用了低速離心-薄膜過濾法和平皿法相結合的實驗方法來進行頭孢拉定膠囊微生物限度檢查，取得了比較理想的實驗效果。報告如下。
1 材 料
1.1 培養基及試藥
營養瓊脂培養基（批號：071008）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：070329）、改良馬丁培養基（批號：061020）、改良馬丁瓊脂培養基（批號：060404）、膽鹽乳糖培養基（批號：060913）、營養肉湯培養基（批號：061113）、MUG培養基（批號：060913）、 分析純氯化鈉(批號：070725)試劑。
1.2 菌 種
大腸埃希菌［CMCC(B)44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(B)98001］、黑曲黴［CMCC(B)98003］，均由江蘇省藥檢所提供。
1.3 主要儀器設備
HHB11360型電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；DG2型多功能恒溫箱（上海醫療器械廠）；ZF7C型三用紫外分析儀（上海慧鑫科學儀器有限公司）；YXQ LS75SⅡ型全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上betway必威西汉姆联迅實業有限公司醫療設備廠）；1013A鼓風幹燥箱（通州市滬通製藥機械設備廠）；HTY-2000A集菌儀（杭州泰林醫療器械廠）；800型離心沉澱器（江蘇江陰科研器械廠）。
1.4 樣 品
頭孢拉定膠囊，規格：0.25 g，批號：071003， 071113， 071201。生產單位：江蘇聚榮製藥集團有限公司。
2 方 法
2.1 細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證［1］
2.1.1 供試液製備 取供試品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液100 ml，於45℃水浴中保溫、浸泡、振搖溶化，製成1∶10的供試液。
2.1.2 菌液的製備 (1) 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鮮培養物1白金耳分別接種至10 ml營養肉湯培養基中，30～35℃培養18～24 h，分別取上述培養物1 ml加入9 ml 0.9％的無菌氯化鈉溶液內以10倍遞增稀釋製成每1 ml含菌數 50～100 cfu的菌懸液。(2) 將白色念珠菌的新鮮培養物1白金耳接種至10 ml 改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48 h，取上述培養物1 ml加入9 ml 0.9％的無菌氯化鈉溶液內以10倍遞增稀釋製成每ml含菌數50～100 cfu的菌懸液。(3)將黑曲黴的新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜麵培養基上，23～28℃培養5～7 d，使大量孢子產生。加入0.9％無菌氯化鈉溶液5 ml,用無菌玻棒輕輕將孢子洗脫，然後用一支管口包有無菌棉花且能過濾菌絲的10 ml吸管吸出孢子液至無菌試管內，用0.9％的無菌氯化鈉溶液稀釋再與標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當後，再逐步稀釋製成每ml含孢子數 50～100 cfu的孢子懸液。
2.1.3 驗證方法 本品對細菌生長有強抑製作用，藥典所規定的三株驗證實驗用菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌對本品均較為敏感，所以本品的細菌數測定應采用薄膜過濾法。本品為膠囊劑，由於囊殼中的明膠使供試液在常溫下易成凝膠狀，而造成取樣困難，濾膜堵塞，所以應注意操作全過程保持45℃。本製劑中含有一定量的不溶性輔料，宜采用低速離心-薄膜過濾聯合應用。由於本品對真菌沒有抑製作用，進行黴菌及酵母菌計數無需采用薄膜過濾法，使用常規法（平皿法）即可使白色念珠菌和黑曲黴的回收率達到要求。
2.1.3.1 細菌計數方法的驗證（低速離心-薄膜過濾聯合應用） （1）供試液的製備。取1∶10的供試液10 ml注入離心管中，500 r/min，離心5 min。取上清液置另一離心管中，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至10 ml。（2）試驗組：用少量的稀釋劑將薄膜過濾器內的濾膜濕潤。取低速離心後製備的供試液1 ml加於pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液100 ml中過濾，再用400 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液衝洗濾膜，泵速為160轉，衝洗3次後將含50～100 cfu／ml大腸埃希菌的菌懸液1 ml加入剩餘的100 ml衝洗液中過濾。取出濾膜菌麵朝上，貼於含2 ml β內酰胺酶營養瓊脂培養基平板上，30～35℃培養48 h。對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的驗證同法操作。（3）菌液組：分別取上述稀釋的三株驗證用菌的菌懸液各1 ml，按照平皿菌落計數法測定其試驗菌數。（4）供試品對照組：按“2.1.3.1”（2）法（不加試驗菌）操作測定供試品的本底菌數。（5）稀釋劑對照組：按“2.1.3.1”（2）法（用稀釋劑代替供試品）操作對稀釋劑進行驗證。
2.1.3.2 黴菌及酵母菌計數方法的驗證（平皿法） （1）試驗組：取1∶10的供試液1 ml分別加入4個平皿內，再依次加入白色念珠菌、黑曲黴菌懸液1 ml（50～100 cfu／ml），每株菌平行製備2個平皿，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，23～28℃培養72 h。（2）菌液組：分別取上述兩株稀釋的菌懸液各1 ml，注入平皿內，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每個菌平行製備2個平皿，以測定所加的試驗菌數。（3）供試品對照組：取1∶10的供試液1 ml，注入2個平皿內，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，以測定供試品的本底菌數。（4）稀釋劑對照組：本品未用特殊方法處理和製備。
上述方法獨立平行實驗3次。
2.1.3.3 頭孢拉定膠囊菌落計數回收率測定實驗結果 頭孢拉定膠囊細菌計數采用低速離心-薄膜過濾聯合應用，3次平行試驗中均可使本品中所汙染的三株驗證（細菌）用菌的回收率達70％以上，說明用本法測定細菌計數結果是正確的。而采用平皿菌數計數法，3次平行試驗中的兩株驗證（真菌）用菌的回收率均達70％以上，說明該法可用於黴菌及酵母菌計數。實驗結果見表1。表1 頭孢拉定膠囊菌落計數回收率測定實驗結果
2.2 控製菌檢查方法的驗證
2.2.1 供試液的製備（同菌落計數方法驗證）
2.2.2 菌液製備 分別挑取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養物1白金耳，各接種至10 ml營養肉湯培養基中，30～35℃培養18～24 h，取搖勻培養物1 ml，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋製成每ml含菌數50～100 cfu的菌懸液。
2.2.3 大腸埃希菌檢驗方法的驗證
2.2.3.1 試驗組 取1∶10供試液10 ml經低速離心後製備的供試液（上清液），參照細菌計數測定方法進行薄膜過濾處理，轉膜至含2 ml β內酰胺酶100 ml膽鹽乳糖增菌液內，加入含86 cfu／ml的大腸埃希菌菌液1 ml，35～37℃培養18～24 h，可見培養基渾濁，有氣體產生。取上述培養液0.2 ml接種至5 ml MUG培養基的試管內，培養5，24 h，在366 nm紫外線下觀察，可見藍白色熒光，滴加靛基質試液，液麵呈玫瑰紅色。
2.2.3.2 陰性菌對照組 取1∶10供試液10 ml，按“２.2.3.1”方法操作，加入含菌數75 cfu／ml金黃色葡萄球菌菌液1 ml，35～37℃培養18～24 h，培養基無渾濁，無氣體產生。取上述培養液0.2 ml接種至5 ml MUG培養基的試管內，培養5，24 h，在366 nm紫外線下觀察，無藍白色熒光，滴加靛基質試液，液麵呈試劑本色。
2.2.3.3 驗證結果 試驗組檢出了大腸埃希菌，陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌，說明頭孢拉定膠囊經低速離心-薄膜過濾聯合應用處理後可以消除本品對大腸埃希菌的抑製作用。100 ml膽鹽乳糖增菌培養基可用於本品的大腸埃希菌的檢查。
3 結 論
頭孢拉定膠囊細菌數測定可采取低速離心-薄膜過濾聯合應用的方法進行；黴菌及酵母菌數測定可用平皿菌落計數法檢驗；大腸埃希菌檢查時，可取1∶10供試液10 ml，用低速離心-薄膜過濾聯合應用處理後，加入含2 ml β內酰胺酶的100 ml膽鹽乳糖增菌培養基進行增菌培養，依法進行檢查。
4 討 論
根據《中國藥典》微生物限度檢查方法之規定，含抑菌成分的製劑，必須消除供試液的抑菌活性，然後再進行微生物限度檢查。通過實驗，我們認為：
(1)本品對細菌生長有強抑製作用，藥典所規定的三株實驗菌對本品均較為敏感，所以本品的驗證必須采用薄膜過濾法。
(2)由於本品輔料的影響，容易造成濾膜堵塞，應首先經過低速離心（500 r/min離心5 min）去除輔料，取上清液經100 ml衝洗液進一步稀釋，才能較順利地通過濾膜。
(3)驗證實驗表明，本品按照一般薄膜過濾法處理仍然難以去除頭孢拉定的抑菌活性成分，三株細菌的回收率往往達不到要求。本實驗參照青黴素類係列產品無菌檢查中添加β內酰胺酶加入膽鹽乳糖增菌培養基中的方法，三株驗證菌的回收率均符合要求。
(4)製備含β內酰胺酶營養瓊脂平板時應注意控製實驗溫度於(45±1)℃，實驗溫度過高會造成酶蛋白失活而影響實驗的準確性。
（5）由於本品對真菌沒有抑製作用，驗證實驗中，采用常規法（平皿法）測定即可使真菌類的兩種實驗用菌回收率均符合要求。
作者：樊寶才 張麗珍
【參考文獻】
［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.2部.北京：化學工業出版社,2005:附錄94-96.
［2］ 中國藥品生物製品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規範［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2005：330.
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