［關鍵詞］ 真菌菌種；蓋玻片；棉蘭染色液
真菌的種類很多，在自然界分布極廣，它的形態結構複雜，菌絲體和孢子的形態特征隨真菌種類不同而異，是鑒別真菌的重要依據。傳統的真菌染色方法，常常造成真菌孢子脫落，從而改變了它原有的形態構造，影響觀察、鑒定［1］。我們經多次反複摸索，利用真菌菌絲體呈上聳向空間生長特征，用插片法使菌絲體生長在蓋玻片上，這樣製作的真菌染色片效果更為理想，在以往的文獻中還未見報道。現將本方法報道如下。
1 材料與方法
1．1 菌種
青黴菌、黑曲菌、黃曲菌、毛黴菌、石膏樣小孢子菌、絮狀表皮癬菌等，以上菌種均為本實驗室保存提供。
1．2 染液的配製染液
苯酚(結晶品)20 g，乳酸20 ml，甘油40 ml，棉蘭(Cotton blue)0．05 g，蒸餾水20 ml，將苯酚、乳酸、甘油溶解於蒸餾水中(可微加熱)，再加入棉蘭，搖勻，備用。
1．3 沙氏培養基的製備
蛋白腖10 g，葡萄糖40 g，瓊脂1 g，蒸餾水1 000 ml，68.95 kPa，20 min，備用［2］。
1．4 方法
1．4．1 設試驗組與對照組兩組，各染片100張。試驗組即改良的真菌染色法［4］，將沙氏培養基傾注大平板，取無菌蓋玻片沾上融化的沙氏培養基，密集豎立插在大平板上，將上述菌種用滅菌蒸餾水輕輕刮下，滴在大平板上，並輕輕搖動，使之均勻分布於平板表麵，蓋上平板蓋，於25 ℃～28 ℃濕盒孵育，72 h取出後，用鑷子輕輕取出蓋玻片，用火焰固定或自然晾幹後，滴上棉蘭染色液，2 h~3 h後，於水中輕柔漂洗，然後晾幹，放載玻片上封片。對照組即傳統的真菌染色法，在無菌載玻片上滴加融化的沙氏培養基1滴~2滴，將菌種接種在沙氏培養基上，加蓋無菌蓋玻片，於25 ℃～28 ℃濕盒孵育，72 h取出後，揭開蓋玻片，滴加染液，使真菌培養物與棉蘭染液混合染色［3］。
4．2 染色效果評判標準
優片：鏡下觀察可見真菌菌絲體和孢子形態保持自然完整，孢子基本沒有脫落，底影幹淨、清晰；良片：在鏡下觀察可見大部分菌絲與孢子形態較為完整、有少許脫落、底影較髒；差片：在鏡下觀察可見孢子與菌絲分離、脫落、底影髒，形態不完整。
2 結果
試驗組：染片100張屬優片有80張，良片有10張，差片有10張；對照組：染片100張屬優片有10張，良片有10張，差片有80張。兩組優片率比較差異有統計學意義(P<0.01)。
3 討論
兩種不同染色方法的結果比較，可以看出製片效果有以下明顯差異：傳統法由於菌種接種在載玻片瓊脂培養，棉蘭液染色時，染料掛有瓊脂，鏡下可見底影髒，影響檢測效果；改良法是直接滴加棉蘭染液在蓋玻片上進行染色，這樣有效減少雜質的幹擾，提高底影潔淨度，鏡下可見幹淨、清晰；傳統法掀開蓋玻片，容易使孢子與菌絲分離、脫落；改良法是利用真菌菌絲體和孢子向上生長構造，菌絲體和孢子生長在蓋玻片上，使真菌形態保持自然完整。我們經多次反複實踐證明，本法簡單、易掌握，效果好並適合大批量快速製片，不失為一種真菌染色的新方法。
參考文獻：
［1］張子康，何光澤，等．醫學微生物學與免疫學實驗教程［M］.第1版．四川：四川科學技術出版社，1989：7．
［2］陸德源.醫學微生物學［M］.第5版.北京：人民衛生出版社，2002，11(5).
［3］淩啟波，梁英傑．常見真菌的形態學特征和常用染色方法［J］．臨床與實驗病理學雜誌，2003，10：19．
［4］陳倪勇，肖永波．介紹一種真菌的方法［J］.中華病理學雜誌，2001，10．
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