液芯包囊化清酒乳杆菌增殖培養基的優化（1）

關鍵詞：液芯包囊；清酒乳杆菌；乳清粉；增殖培養基；響應曲麵法  

直投式發酵劑加工發酵乳是當今發酵乳工業化生產的發展方向。發酵劑的質量將直接影響發

酵乳的品質，而高濃度菌體的獲得又是研製高效濃縮型發酵劑的關鍵。傳統的乳酸菌培養采用遊離細胞懸浮培養，生產效率低，細胞密度低， 細胞分離難，成本高。 包囊化乳酸菌避免了傳統發酵劑的缺點和限製，細胞密度可達到10¹⁰ cfu／g以上，從培養基中分離細胞不需經過超濾或冷凍離心，而用普通的過濾就可進行，因此大大降低了生產成本。無論采用何種技術和方式來生產高效濃縮型直投式發酵劑，都必須首先獲得使乳酸菌能夠大量生長的增菌培養基。適合工業化生產的乳酸菌培養基必須基於原料易得、 價格低廉、 菌體產量高^［2］。  

乳清是乳品工業的副產品，主要成分為乳糖，還含有蛋白質及無機鹽等成分。 必需氨基酸、 礦物質和B族維生素的含量也較豐富l   3 l 。本研究以乳清粉為基礎培養基，補充適當碳、氮源，促生長因子，pH緩衝劑，用於自發酵肉中分離的清酒乳杆菌包囊化高密度培養。   

1材料與方法

1．1實驗材料

1．1．1供試菌株

清酒乳杆菌 ( Lactobacillus sake L．S—MA 3一l0)，本實驗室分離和保藏。   

1．1．2培養基

菌種活化培養基：MRS培養基^［4］。 

活菌計數培養基：MR S培養基。

細胞增殖基礎培養基：乳清粉6％，葡萄糖2％，酵母粉2％，CaCO₃ 0．5％，MgSO₄  0．028％， MnSO₄ 0．005％。 

番茄汁的製備：將新鮮番茄洗淨，切碎，放人三角燒瓶，置4℃冰箱 8一l2h，取出後用紗布過濾即成。

胡蘿卜汁的製備： 將新鮮胡蘿卜洗淨，切碎，加等量水煮沸 20—30main， 離心收集上清。

1．2實驗方法

1．2．1液芯包囊的製備^［5,6］ 

將甘油管保存的菌株L．sake 用MRS液體培養基活化兩次，發酵液離心收集菌體，加入少許生理鹽水懸浮菌泥，再倒入1．5％ (w／v )CaC1₂ 溶液與0．3％(w／v ) 黃原膠溶液的混合液中製成菌懸液。  

將菌懸液置入已滅菌的l0 mL注射針筒中，逐滴滴入磁力攪拌的0．8％ (w／v) 海藻酸鈉溶液中(含 0．1％吐溫一80)， 所形成的液芯包囊過濾後用生理鹽水洗滌， 轉移到2％ (w／v)CaC1₂溶液中硬化處理1h，然後將過濾並用生理鹽水洗滌過的包囊置於0．3％(w ／v ) 殼聚糖溶液中，在定軌搖床上輕微搖30min，最後生理鹽水洗滌，收集包囊。 

1．2．2液芯包囊清酒乳杆菌的增殖培養

按實驗設計 配製培養基，108滅菌 2 0mi n，冷卻後，以l％(w／v )的固定化包囊接種， 置搖床內，轉速為80r／min，37℃培養20h後，過濾進行包囊內細胞計數。   

1．2．3囊內細胞計數用^［7］ 

無菌稱取1g包囊，放入99mL滅菌的檸檬酸鈉溶液中(1％( w／v )，pH 6．0)，待包囊完全溶解後，用無菌生理鹽水逐級稀釋後進行平板計數。 

1．3實驗設計

1．3．1單因素實驗設計

將不同的碳源、 氮源、 促生長因子及不同濃度的pH緩衝劑CaCO₃分別添加到培養基中，按1％的接種量放入包囊化清酒乳杆菌，調節起始pH，在一定溫度下培養一定的時間，進行囊內細胞計數。  

1．3．2響應曲麵實驗設計

在單因素試驗基礎上，確定包囊化清酒乳杆菌增殖的生長強化因子，采用響應麵分析尋求多因素係統中培養基組分的最佳優化條件。      

本實驗采用旋轉中心組合設計（Central Composite Rotatable Design， CCRD ) 法， 選擇葡萄糖、蛋白腖、番茄汁以及CaCO₃ 四個因子為研究對象，以菌體濃度為響應值，設計試驗，對實驗數據進行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應和交互效應，最後在一定水平範圍內求取最佳值。

本階段實驗輔助軟件為Design Expert 軟件(Version6．0．10，Stat - Ease．，Minneapolis，MN．USA)。實際考察的變量及其實驗編碼見表1。

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