【摘要】 目的 分離純化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ZY-1)溶栓酶,探討該酶的理化性質。 方法 枯草芽孢杆菌培養,利用(NH4)2SO4沉澱、Sephadex G-100 柱層析對該酶發酵液進行分離純化,利用四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作為底物,研究酶的理化性質。 結果 經發酵並純化後獲得的酶液其比活高達26 400 U/mg,酶反應最適溫度45 ℃,最適pH 8.0,且具有較好的熱穩定性。 結論 枯草芽孢杆菌溶栓酶具有溶血栓作用。
【關鍵詞】 芽孢杆菌,枯草; 纖溶酶
ABSTRACT: Objective Purification of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis ZY-1 and investigation of its activity and characterization. Methods A high fibrinolytic enzyme was purified with (NH4)2SO4 fractionation and sephadex G-100 gelfiltration chromatography, and characterization was investigated by check the enzymatic activities in different conditions. Results The specific activity of enzyme was 26 400 U/mg, and its optimal temperature and pH was 45 ℃ and 8.0, respectively. The enzyme had fine thermal heat stability. Conclusion The enzyme had potential commercial value.
KEY WORDS: Bacillus subtilis; plasmin
目前常用治療血栓病的藥品有鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、重組組織纖溶酶原激活劑(t-PA)和尿激酶原(pro-UK)等［1］。但它們在不同程度上存在不足,如SK的抗原性強,不可連續用藥超過7 d,UK雖然可連續使用半個月無抗原性,但體內半衰期僅3~20 min,且長期大量用藥有全身性出血的傾向,口服一般無效［2-4］。1987年日本學者在傳統發酵食品納豆中發現一種由枯草芽孢杆菌產生的具有強烈纖溶活性的絲氨酸蛋白酶,定名為納豆激酶(nattokinase,NK)［5］,該酶口服可通過腸道迅速吸收並釋放入血,溶栓效率高,藥效時間長,有望開發成新型口服溶栓劑［6-7］。本課題組在豆豉食品中篩選出一株產溶栓酶活性很高的枯草芽孢杆菌,探討其產酶條件、提取工藝等以期提高其溶栓酶活性和產量。筆者報告該酶的分離純化及其酶學性質。
1 材料與方法
1.1 材料
菌株:依據中國豆豉生產方法,製作豆豉［8］,經發酵實驗,從中篩選出1株在發酵產物中產生高纖溶活性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ZY-1)作為出發菌株。試劑:凝膠Sephadex G-100(美國Pharmacia公司);底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(英國NEB公司);牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250(美國Amresco公司);其他試劑均為國產分析純。LB培養基:1%胰蛋白腖,0.5%酵母粉,1%NaCl。固體LB培養基:1%胰蛋白腖,0.5%酵母粉,1%NaCl,2%瓊脂粉。發酵培養基:2%大米粉,4%豆粕粉,0.04%CaCl2,0.4%K2HPO4,0.2%KH2PO4,0.07%MgSO4。在發酵培養基100 mL中接種液體菌種6 mL,37 ℃,搖床轉速為180 r/min,發酵72 h。
1.2 方法
1.2.1 溶栓酶分離純化
取含溶栓酶的發酵液,經9 000 r/min離心、30%~70%(NH4)2SO4分步沉澱,9 000 r/min再離心,沉澱用0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.2)緩衝液溶解後透析濃縮得粗酶液［9］。Sephadex G-100 柱(上海華美實驗儀器廠)層析分離純化溶栓酶:按常規方法處理的Sephadex G-100裝入層析柱(1.5 cm×45 cm),用0.02 mol/L HCl-Tris (pH 7.2)緩衝液平衡。將已濃縮的粗酶液1 mL加入柱中,以相同緩衝液1 mL/min流速洗脫,以每1 mL/min為一管分部收集,用四肽底物法檢測洗脫液,收集含有活性的組分。
1.2.2 SDS-PAGE分析
製備12%分離膠,5%濃縮膠,上樣量20 μL,30 mA穩流電泳(DYY-11型電泳儀,北京市六一儀器廠),用考馬斯亮藍R250染色［10］。
1.2.3 溶栓酶活性測定
在四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA溶液中加入豆豉溶栓酶酶液1 μL(稀釋10倍),37 ℃中孵育1 min,測定單位時間內405 nm處光吸收的變化。酶的活性單位定義為:1 min水解該四肽底物生成1 μmol對硝基苯胺的豆豉溶栓酶量為1 U。
1.2.4 溶栓酶性質檢測
利用四肽Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作為底物,研究溫度、pH值、金屬離子、有機溶劑對該酶的影響。
1.2.4.1 熱穩定性
取酶液1 μL和1 mmol/L底物49 μL溶於0.02 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩衝液50 μL,在不同溫度(25,35,45,55,65,75,85 ℃)下反應1 min測定酶活性。
1.2.4.2 pH值
取酶液1 μL和1 mmol/L底物49 μL分別溶於不同pH的緩衝液50 μL (pH 4.0,5.0為0.05 mol/L醋酸緩衝液,pH 6.0,7.0,7.5,8.0為0.05 mol/L磷酸緩衝液,pH 9.0,10.0為0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液,pH 11.0,12.0為0.05 mol/L磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩衝液)於37 ℃反應1 min,測定酶活性。
1.2.4.3 金屬離子
取酶液1 μL和1 mmol/L NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2等溶液10 μL溶於0.02 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩衝液40 μL,於37 ℃靜置30 min,分別加入1 mmol/L底物49 μL,於37 ℃反應1 min,測定酶活性。
1.2.4.4 有機溶劑
以甲醇、乙醇、異丙醇3種不同有機溶劑為效應物,測定酶活性。
1.2.5 溶栓酶體外對血凝
奶牛體表采血。取4支裝有血液1 mL的試管分別加入等體積的稀釋倍數不同的酶液，將其放入在37 ℃水浴鍋中保溫10 min後觀察。
2 結 果
2.1 枯草杆菌溶栓酶的純化
溶栓酶在第2個洗脫峰(圖1)。純化結果見表1。純化倍數3.41,回收率10.29%。表1 溶栓酶的純化（略）
2.2 溶栓酶的SDS-PAGE
溶栓酶經純化步驟後得到純酶,其相對分子質量為32 kD(圖2)。
2.3 溶栓酶的理化性質
2.3.1 最適溫度
溶栓酶活性最大時的溫度為45 ℃(圖3)。
2.3.2 熱穩定性
溶栓酶在<45 ℃保持穩定,達99％。55 ℃活性有所喪失(約7％),>65 ℃活性全部喪失。酶液反複在－20 ℃凍融4次,活性仍保持在93%以上。
2.3.3 最適pH
溶栓酶活性最大時的最適pH為8.0(圖4)。
2.3.4 pH穩定性
酶液中加入1 mmol/L底物49 μL,溶栓酶在pH 7.0~10.0較穩定,酶活性>90％。
2.3.5 金屬離子的影響
Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Cu2+,Fe3+對溶栓酶有一定的抑製作用,Mn2+，Ba2+對溶栓酶有較強的抑製作用(酶活性<40％),Al3+,Zn2+可提高溶栓酶的活性(酶活性112％和118％)。
2.3.6 有機溶劑的影響
以甲醇、乙醇、異丙醇3種不同有機溶劑為效應物,研究有機溶劑對溶栓酶活性的影響。當甲醇濃度在10%~15%時,相對酶活性下降達30％。但隨濃度繼續增大,相對酶活性變化趨於平穩。乙醇在濃度<20%時,對酶活性略有激活作用;當濃度為10%時激活作用達到最大,可使酶活性提高13%;當濃度>20%時,酶的活性反而被抑製。異丙醇對溶栓酶總體表現為激活作用,其在所選擇的有機溶劑中,激活作用最強,尤其在低濃度時(<5%),使酶活性提高70%,但隨濃度的增大,激活作用漸漸減弱。當濃度>25%時,開始抑製酶的活性。
2.3.7 溶栓酶體外對血凝的影響
管1所加酶液濃度最高,試管內的血液仍為均勻的流體體係。管2~4血液不是均勻體係,試管底部均有不溶血塊,其大小依次增大(圖5),說明溶栓酶體外對抗凝血的作用隨酶液濃度的增大而增大。
3 討 論
3.1 豆豉溶栓酶是從中國傳統食品中發現的新型溶栓酶,具有較高的纖溶活性,且安全無毒,持續時間長，相對分子質量小,可通過消化道直接吸收［4,11］。本研究利用(NH4)2SO4沉澱、Sephadex G-100柱層析對該酶發酵液進行分離純化,酶的得率為10.29,相對較低,主要原因是在純化過程中操作步驟較多,損失較多,今後將繼續摸索條件,控製純化的工藝條件提高酶得率。
3.2 本研究所得枯草芽孢杆菌產生的溶栓酶的最適反應溫度和pH為45 ℃和8.0,具有一定的熱穩定性。由於胃中的pH環境呈酸性,所以本研究開發的溶栓酶不適於口服,應考慮取注射液形式。該酶的米氏常數（Km）、最大反應速度（Vmax）等酶反應動力學常數特征有待進一步研究。
3.3 基於非水酶學的興起,本實驗以甲醇等3種不同有機溶劑為效應物,研究在不同有機溶劑的不同濃度下,溶栓酶催化活性的變化趨勢。實驗發現,甲醇對溶栓酶的效應表現為抑製作用;乙醇在低濃度時略有激活作用,但在達到一定濃度(>20%)後酶活性反而被抑製,且抑製作用明顯強於甲醇。甲醇和乙醇均屬於親水性有機溶劑,它們對酶的抑製作用可能是由於有機溶劑剝奪了酶周圍的水化層,致使由水分子直接或間接參與形成的氫鍵、疏水鍵及範德華力等受到破壞,從而引起酶構象的劇烈改變而使酶活性下降。而異丙醇對酶的激活效應,可能是由於它們能介入酶分子的內部,改變酶分子所處環境的介電常數,引起肽鏈伸展,從而改變了酶活性中心必需基團所處的微環境極性,影響了酶的催化活性。
3.4 本實驗以牛血為對象,觀察不同濃度酶液對血凝的影響,隨著酶液稀釋倍數的增大,其抗凝血作用減弱,證明從本實驗枯草芽孢杆菌LD-8547發酵後所提取的酶液具有溶血栓作用,具有開發應用價值。
【參考文獻】
［1］付 利,楊誌興．納豆激酶的研究與應用［J］. 生物工程進展, 1995,15(5):46-49.
［2］Nakajima N,Taya N,Sumi H. Potent fibrinolytic enzyme from the lysate of Katsuwonus pelamis digestive tract(Shiokara):purification and characterization［J］. Biosci Biotech Biochem, 1993,57(9):1604-1605．
［3］徐 仲,趙曉東,鄭稚鶯,等. 納豆激酶的純化及活力測定［J］. 生物技術, 1997,7(1):16-18.
［4］Pannall R. Pro-urokinase,A study of its stability in plasma and of a mechanism for its seletivite fibrinolytic effect［J］. Blood, 1986,67(1):12-15.
［5］Sumi H,Hamada H,Tsushima H,et al. A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase) in the vegetable cheese natto. A typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］. Experimenfia, 1987,43(20):1110-1111.
［6］Fuj M,Hong K,Ho Y,et al. Transport of nattokinase across the rat intestinal tract［J］. Biol Pharm Bull, 1995,18(9):1194-1196.
［7］Kim W,Choi K,Kim Y,Park H,et al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang［J］. Appl Envimnm Microbiol, 1996,62(7):2482-2488.
［8］董明盛,江 曉,劉 誠,等. 胞外纖溶酶產生菌的篩選及其產酶條件研究［J］. 食品與發酵工業, 2002,27(1):23-27.
［9］閻家麟,童 岩,臧瑩安. 豆鼓纖溶酶的純化及其性質研究［J］. 藥物生物技術, 2000,7(3):149-152.
［10］肖 璐,張仁懷,張義正. 豆鼓溶栓酶工程菌的發酵條件及重組溶栓酶的分離純化［J］. 食品與發酵工業, 2004,31(1):66-69.
［11］Omura K,Hitosugi M,Kaketani K,et al．Biofactors,fibrinolytic and anti-thrombotic effect of NKCP,the protein layer from Bacillus subtilis(natto)［J］. Biofactors, 2004,22(1-4):l85-l87.
