作者：崔堂兵，劉煜平，郭勇，劉治猛
摘要：對枯草芽孢杆菌BS-06產生抗真菌素的條件進行優化，確定最佳發酵條件為：培養時間為48h，裝液量為50mL，初始pH值為8.0，培養基中添加2%麥芽糖、0.2%硝酸鉀和1%吐溫-80。指出枯草芽孢杆菌BS-06產生的抗真菌素具有較廣的抗菌譜，對水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、節瓜和冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌均有較好的抗菌效果，有望開發成生物農藥來防治農作物病原真菌。
關鍵詞：枯草芽孢杆菌；農用抗生素；抗真菌素；病原真菌
病原真菌會引發多種疾病，特別是植物病原真菌引起的植物病害已經位居植物三大類病害（真菌病害、細菌病害和病毒病害）之首，如在水稻上發生的240多種病害中，真菌病害占90%。真菌引起植物的多種病害，不僅影響農作物的產量及經濟動物的生長，而且還造成極大的經濟損失。
長期以來，在防治植物真菌病害中，人們大量使用化學農藥，導致了三大難題：（1）環境汙染，殘毒積累，最終危害人類的健康；（2）病原真菌抗藥性直線上升；（3）殺死有益微生物，破壞了植物體內微生物種群的平衡，致使病原真菌成為優勢種群，加劇病害的暴發流行。微生物來源的抗真菌抗生素作為生物農藥的一個重要分支，具有高效、易分解、無殘留、不汙染環境等優點，因而日益受到人們的重視。目前已經被廣泛應用於防治植物真菌病害的有井岡黴素、春雷黴素、多抗黴素、農抗120、中生菌素、武夷菌素、新多氧黴素、慶豐黴素等。我們從土壤中分離得到1株產抗真
菌物質（抗真菌素）的菌株，經鑒定屬枯草芽孢杆菌，命名為BS-06。該菌產生的抗真菌素對農業上多種致病真菌具有良好的抗性，可望開發成為環保型的生物農藥。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
1.1.1 供試菌株 枯草芽孢杆菌BS-06 菌株由華南理工大學生物科學與工程學院生化實驗室分離、鑒定和保存，水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌為廣東省農科院水稻研究所保存，節瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌和苦瓜枯萎病菌為廣東省農科院蔬菜研究所保存。
1.1.2 培養基
PDA培養基平板：新鮮馬鈴薯去皮後，取200g切成小塊，加1000mL蒸餾水，煮沸30min後用紗布過濾，得馬鈴薯浸汁；然後加入葡萄糖和瓊脂粉各20g，充分溶解後，於121℃下滅菌後倒平板，每個直徑9cm的培養皿中倒20mL，冷卻後備用。
種子培養基：取牛肉膏0.8g、酵母粉0.5g、葡萄糖1g，溶於 100mL 蒸餾水中，於121℃ 下滅菌後備用。
發酵培養基：生長曲線和抗真菌素積累曲線實驗 取1000mL蒸餾水中加入牛肉膏8g、酵母粉5g、葡萄糖5g、NaH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2·2H20 0.2g，分裝於250mL三角瓶中，裝液量為50mL，自然 pH 值，於121℃下滅菌後備用。其他實驗的無機鹽成分相同，並根據不同實驗目的添加不同種類和不同濃度的碳源、氮源、吐溫-80，除不同 pH 值實驗外均采用自然pH，除不同裝液量實驗外裝液量均為50mL。
1.2 試驗方法
1.2.1 生長曲線和抗真菌素積累曲線的測定 取斜麵菌種 1 環，接種於種子培養基中，在搖床上於 150r/min、30℃.條件下培養12h，作為種子液。按5%的接種量分別接種到上述液體發酵培養基中，在搖床上於150r/min、30℃.下培養，每12h 取出3瓶，用分光光度計測定發酵液 600nm 的 OD 值。將各發酵液分別置於6000r/min 下離心 15min，取上清液，進行抗真菌效果實驗。
1.2.2 發酵條件優化試驗# 取斜麵菌種1 環，接種於種子培養基中，在搖床上於150r/min、30℃ 條件下培養12h，作為種子液。將種子分別接種到液體發酵培養基（無機鹽成分與生長曲線實驗相同，其他實驗根據實驗目的不同添加其他成分）中，在搖床上於150r/min、30℃.下培養48h。取發酵液於6000r/min 下離心15min，取上清液，進行抗真菌效果實驗。
1.2.3 抗真菌效果實驗 除了抗菌譜實驗外，其他實驗均采用水稻紋枯病病菌。取水稻紋枯病等致病菌1 環，接入5mL 無菌水中，振蕩均勻，製成菌懸液。吸取0.1mL 致病菌菌懸液，均勻塗布於 PDA 培養基平板上，然後在平板上打直徑0.5cm 的孔，每個平板打6個孔，於孔內加入離心後的發酵液上清 30uL，置於25℃.培養箱中培養4天，測量抑菌圈直徑（mm），以抑菌圈直徑大小表示抗菌效果。
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