關鍵詞：顯色培養基；沙門氏菌；快速檢測
沙門氏菌是腸杆菌科中一重要致病菌屬，也是引起細菌性食物中毒的主要病原菌之一。隨著食品生產和國際貿易的迅速發展，沙門菌檢測作為食品安全與質量檢測的重要指標，目前國內采用的國標法(GB4789．4—2003)隻適用於沙門菌的選擇性分離培養，不能特異性檢出沙門菌。用顯色培養基檢測細菌是一種新的快速方法，通過在培養基中加入細菌特異性酶的顯色底物，直接觀察菌落顏色就可對菌種作出鑒定。本文通過對培養基的靈敏度、特異性以及實際樣品檢測，比較了CHROMagar沙門菌顯色培養基簡稱(CHROMagar)、HK沙門菌顯色培養基(簡稱HK)與傳統平板DHL的檢測效果。
1 材料與方法
1.1 標準菌株來源 大腸杆菌ATCC25922、費氏檸檬酸杆菌ATCC8090、鼠傷寒沙門菌CMCC(B)50115、金黃色葡萄球菌ATCC6538、腸炎沙門菌CMCC(B)50335、湯卜遜沙門菌CMCC (B)50023、傷寒沙門菌CMCC (B)50071、奇異變形杆菌CMCC(B) 49005、嗜水氣單胞菌GIM1.172、銅綠假單胞菌ATCC9027，均由廣東省微生物研究所提供。
1.2 培養基及試劑CHROMagar沙門菌顯色培養基由法國科瑪嘉公司提供；HK沙門菌顯色培養基基礎和選擇性添加劑由廣東環凱微生物科技有限公司提供；DHL幹粉培養基由北京陸橋技術有限責任公司提供；GNI +試劑條由法國梅裏埃公司提供。
1.3 主要儀器法國生物梅裏埃公司Biomerieux全自動微生物鑒定係統(VITEK32)。
1.4 樣品從廣東省汙染物監測網檢測結果中挑取微生物汙染嚴重的樣品，其中熟食20份，蔬菜、牛奶各10份。
1.5 方法
CHROMagar沙門菌顯色培養基、HKM沙門菌顯色培養基、DHL幹粉培養基均按說明書製備。
將大腸杆菌、費氏檸檬酸杆菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門菌、湯卜遜沙門菌、傷寒沙門菌、奇異變形杆菌、嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌沙門菌參考菌株畫線接種在營養瓊脂培養基上37℃培養24h後，挑取單菌落加到10ml 0.85％生理鹽水中配成原液(n ×108scfu／m1)，然後進行10倍梯度稀釋，取10-5 、10-6 、10-7 菌液各100ul，分別塗布CHROMagar培養基、HK培養基平板，37℃培養24h，觀察菌落特征、量取菌落直徑和計算沙門菌平板的菌落數。
1.6 分離鑒定 將疑似菌落分離純化，用法國梅裏埃公司GNI+ 試劑條進行生化鑒定。
2 結果
2.1 顯色培養基的特異性 CHROMagar培養基、HK培養基均有較好的顯色效果。CHROMagar培養基上的沙門菌菌落為紫色，HK培養基上沙門菌菌落呈現品紅色(見表1)；金黃色葡萄球菌在兩種培養基上均不生長；嗜水氣單胞菌和銅綠假單胞菌在HK培養基上不生長，在CHROMagar培養基上生長且顏色與沙門菌相似(分別為紫色和淺紫紅色)；變形杆菌在CHROMagar培養基上不生長而在HKM培養基上的菌落為白色，可與沙門菌相區分；費氏檸檬酸杆菌和大腸杆菌在兩種培養基上均為藍綠色。
表1 不同沙門菌種的菌株在顯色培養基上的生長情況
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測試菌株名稱 |
CHROMagar沙門氏菌顯色培養基 |
HKM沙門氏菌顯色培養基 | ||||
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菌落顏色 |
菌落直徑（mm） |
菌落數（cfu/皿） |
菌落顏色 |
菌落直徑（mm） |
菌落數（cfu/皿） | |
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鼠傷寒沙門菌 |
藍紫色 |
1.7 |
6.4*108 |
品紅 |
2.15 |
7.9*108 |
|
腸炎沙門菌 |
淺紫色 |
1.77 |
7.4*108 |
品紅 |
2.93 |
1.1*109 |
|
湯卜遜沙門菌 |
藍紫色 |
1.56 |
1.1*109 |
品紅 |
3.07 |
1.4*109 |
|
傷寒沙門菌 |
淺紫紅色 |
1.97 |
7.3*108 |
品紅 |
0.95 |
6.8*108 |
2.2 顯色培養基的靈敏度 由表1可見，塗布相同濃度和劑量的4種沙門菌在兩種顯色培養基平板上，37℃培養24h後，菌落總數和菌落直徑結果均有差異。腸炎沙門菌在HK平板上的菌落數比在CHROMagar平板上約多5倍，湯卜遜沙門菌和傷寒沙門菌的結果較相近。傷寒沙門菌在CHROMagar 培養基上菌落直徑(1.97mm)遠大於HK培養基(0.95mm)，其他3種沙門菌在HK培養基上的菌落大於CHROMagar培養基上的。
2.3 實際樣品檢測 40份實際樣品檢測出的陽性菌株經VITEK32的GNI+ 鑒定，結果詳見表2。
表2 三種培養基檢測40份樣品中沙門菌結果比較
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樣品名稱 |
份數 |
DHL培養基 檢出數（%） |
CHROMagar檢出數（%） |
HK培養基檢出數（%） |
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熟食 |
20 |
16（80.0） |
13（65.0） |
17（85.0） |
|
牛奶 |
10 |
9（90.0） |
9（90.0） |
9（90.0） |
|
生雞肉 |
10 |
9（90.0） |
9（90.0） |
9（90.0） |
|
總計 |
40 |
34（85.0） |
31（77.5） |
35（87.5） |
3 討論
沙門菌廣泛存在於自然界中，主要是通過食品(特別是動物性食品)傳播、感染人體。國標法是目前國內絕大多數檢測機構都在使用的方法，由於其檢測周期長、程序複雜、所需試劑繁多等缺點，已遠遠不能滿足現代檢測要求。顯色培養基法的原理是使用適當的熒光或顯色底物，在細菌特異性酶作用下，產生熒光或顯示一定顏色，用紫外燈觀察細菌產生的熒光或直接觀察菌落顏色，減少對菌株進行純培養和生化鑒定步驟，可以把檢測、計數和鑒定一次完成，縮短檢測周期。
HKM和CHROMagar 培養基上的沙門菌呈現品紅或紫色的菌落與各自特異的酶底物和顯色劑有關。兩種培養基均能抑製金黃色葡萄球菌的生長，大腸杆菌、費氏檸檬酸杆菌、奇異變形杆菌等雜菌或被抑製或菌落顏色與沙門菌有明顯差別。在CHROMagar培養基上，嗜水氣單胞菌和銅綠假單胞菌與沙門菌菌落顏色無法區別，而HK顯色培養基對這兩種菌有良好的抑製作用。從4種沙門菌的塗布培養結果可見，傷寒沙門菌在CHROMagar培養基上的菌落較大，而HK培養基對某些沙門菌檢測的靈敏度比CHROMagar培養基多數倍，菌落直徑也明顯較大。
在實際樣品檢測中，3種培養基對牛奶、生雞肉中沙門菌的檢出率相同，而對熟食樣品檢出率差異較大，原因可能是熟食在生產加工的過程中添加的有機和無機成分種類多且複雜，影響了酶與底物的反應，同時熟食較牛奶和生雞肉雜菌汙染量大，使檢測結果出現一定比例假陽性或假陰性，從而幹擾目標菌的檢測，降低顯色培養基的敏感性和特異性。
綜上所述，顯色培養基在微生物檢測中的應用，可大大提高測效率，滿足應急需要。
作者：朱海明 ，賴蔚苳，盧勉飛，楊冰 ，王海燕 ，柯昌文 ，嚴紀文 ，王建
參考文獻：
[1]餘潑．醫學微生物學[M]．北京：人民衛生出版社，1983，303 305．
[2]吳清平，周豔紅，蔡芷荷．衛生微生物特異性顯色培養基的研究與應用[J]．中國衛生檢驗雜誌，2005，15(1)：124—126．
[3]盧勉飛，吳清平，劉雲林，等．特異性酶反應在食源性致病菌檢測中的應用[J]．中國衛生檢驗雜誌，2005，15(3)：354～356
1.4*109
傷寒沙門菌
淺紫紅色
1.97
7.3*108
品紅
0.95
6.8*108
2.2 顯色培養基的靈敏度 由表1可見，塗布相同濃度和劑量的4種沙門菌在兩種顯色培養基平板上，37℃培養24h後，菌落總數和菌落直徑結果均有差異。腸炎沙門菌在HK平板上的菌落數比在CHROMagar平板上約多5倍，湯卜遜沙門菌和傷寒沙門菌的結果較相近。傷寒沙門菌在CHROMagar 培養基上菌落直徑(1.97mm)遠大於HK培養基(0.95mm)，其他3種沙門菌在HK培養基上的菌落大於CHROMagar培養基上的。
2.3 實際樣品檢測 40份實際樣品檢測出的陽性菌株經VITEK32的GNI+ 鑒定，結果詳見表2。
表2 三種培養基檢測40份樣品中沙門菌結果比較
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樣品名稱 |
份數 |
DHL培養基 檢出數（%） |
CHROMagar檢出數（%） |
HK培養基檢出數（%） |
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熟食 |
20 |
16（80.0） |
13（65.0） |
17（85.0） |
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牛奶 |
10 |
9（90.0） |
9（90.0） |
9（90.0） |
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生雞肉 |
10 |
9（90.0） |
9（90.0） |
9（90.0） |
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總計 |
40 |
34（85.0） |
31（77.5） |
35（87.5） |
3 討論
沙門菌廣泛存在於自然界中，主要是通過食品(特別是動物性食品)傳播、感染人體。國標法是目前國內絕大多數檢測機構都在使用的方法，由於其檢測周期長、程序複雜、所需試劑繁多等缺點，已遠遠不能滿足現代檢測要求。顯色培養基法的原理是使用適當的熒光或顯色底物，在細菌特異性酶作用下，產生熒光或顯示一定顏色，用紫外燈觀察細菌產生的熒光或直接觀察菌落顏色，減少對菌株進行純培養和生化鑒定步驟，可以把檢測、計數和鑒定一次完成，縮短檢測周期。
HKM和CHROMagar 培養基上的沙門菌呈現品紅或紫色的菌落與各自特異的酶底物和顯色劑有關。兩種培養基均能抑製金黃色葡萄球菌的生長，大腸杆菌、費氏檸檬酸杆菌、奇異變形杆菌等雜菌或被抑製或菌落顏色與沙門菌有明顯差別。在CHROMagar培養基上，嗜水氣單胞菌和銅綠假單胞菌與沙門菌菌落顏色無法區別，而HK顯色培養基對這兩種菌有良好的抑製作用。從4種沙門菌的塗布培養結果可見，傷寒沙門菌在CHROMagar培養基上的菌落較大，而HK培養基對某些沙門菌檢測的靈敏度比CHROMagar培養基多數倍，菌落直徑也明顯較大。
在實際樣品檢測中，3種培養基對牛奶、生雞肉中沙門菌的檢出率相同，而對熟食樣品檢出率差異較大，原因可能是熟食在生產加工的過程中添加的有機和無機成分種類多且複雜，影響了酶與底物的反應，同時熟食較牛奶和生雞肉雜菌汙染量大，使檢測結果出現一定比例假陽性或假陰性，從而幹擾目標菌的檢測，降低顯色培養基的敏感性和特異性。
綜上所述，顯色培養基在微生物檢測中的應用，可大大提高測效率，滿足應急需要。
作者：朱海明 ，賴蔚苳，盧勉飛，楊冰 ，王海燕 ，柯昌文 ，嚴紀文 ，王建
參考文獻：
[1]餘潑．醫學微生物學[M]．北京：人民衛生出版社，1983，303 305．
[2]吳清平，周豔紅，蔡芷荷．衛生微生物特異性顯色培養基的研究與應用[J]．中國衛生檢驗雜誌，2005，15(1)：124—126．
[3]盧勉飛，吳清平，劉雲林，等．特異性酶反應在食源性致病菌檢測中的應用[J]．中國衛生檢驗雜誌，2005，15(3)：354～356
