顯色培養基在單核細胞增生李斯特菌快速檢測中的應用研究（1）

 [摘要] 目的：研究顯色培養基對單核細胞增生李斯特菌的檢測效果，探討建立新型快速檢測方法。方法：檢測按國標GB4789—33程序進行。結果：人工汙染樣品和實際樣品檢測中，顯色培養基CHROMagar Listeria和HKListeria與傳統平板OXA和MMA可以達到相同的檢測限和靈敏度，且具有更高的特異性。結論：用顯色培養基檢測單核細胞增生李斯特菌是一種新途徑，可大大提高檢測效率。

[關鍵詞] 顯色培養基；單核細胞增生李斯特菌；快速檢測              

單核細胞增生李斯特菌(簡稱“單增李斯特菌”)是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在於肉類、禽類、乳製品等食品中，引起新生兒腦膜炎和成人敗血症等疾病，是食品微生物的常檢項目之一。美國食品和藥品管理局(FDA)、美國農業部(USDA)、ISO11092標準、國際分析委員會(AOAC)和中國國標(GB4789—33)等都建立了各自的檢測方法，所用培養基包括OXA、PAL、MMA、MOX、TSA—YE等，但隻適用於李斯特菌的選擇性分離培養，不能特異性分離單增李斯特菌。目前仍需一種選擇性平板可以有效的分離單增李斯特菌。鑒於此，一些顯色培養基如CHROMagar Listeria(法國科瑪嘉)、HKListefia(廣東環凱)等不斷開發出來，用於單增李斯特菌的快速檢測中，直接根據菌落顏色和形態就可對菌種作出鑒定，大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率。本文通過對人工汙染樣品和實際樣品檢測，比較了CHROMagar Listeria、HKListeria與傳統平板OXA、MMA的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

單增李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC94002、大腸杆菌Escherichia coli 8099、沙門菌Salmonella typhi、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蠟樣芽孢杆菌Bacillus cereus、糞鏈球菌Enterococcus faecalis、英諾克李斯特菌L.innocua(簡稱“英諾克”)、威爾李斯特菌L.welshimeri(簡稱“威爾”)分離株由廣東省微生物研究所微生物檢測新技術發展中心提供。

1.2 培養基及試劑

HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA、MMA、TSA-YE、LB1、LB2李斯特菌增菌液、萘啶酮酸、丫啶黃、李斯特菌生化鑒定管等由廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器

法國生物梅裏埃公司Biomerieux全自動微生物鑒定係統，API Listeria生化檢測試劑條。

1.4 樣品

試驗所用樣品豬肉、牛肉、雞肉、魚肉、熟食、蔬菜、蛋糕等，均采集於附近超市和肉菜市場。

1.5 方法

1.5.1 培養基製備  HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA按生產廠家的說明書製備，MMA、TSA-YE按國標GB4789-33法配製。

1.5.2 顯色培養基特異性檢驗   將單增李斯特菌、英諾克、威爾、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞杆菌、糞鏈球菌在腦心浸液瓊脂，大腸杆菌、沙門菌在營養瓊脂培養基上培養24 h後，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA、MMA培養基，37℃培養24 h，觀察。

1.5.3 顯色培養基靈敏度檢驗  (1)挑取1環單增李斯特菌加到10 ml 0.85％ 生理鹽水中配成原液，然後進行10倍梯度稀釋，取10^-4、10^-5、10^-6 菌液各100ul ，分別塗布HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE平板。37℃ 培養36h，計數菌落數。(2)取單增李斯特菌10^-3～10^-8濃度菌液，分別加入2．1×10⁴cfu／ml金黃色葡萄球菌、1.4×10⁴ cfu／ml蠟樣芽孢杆菌、1.6×10⁴ cfu／ml大腸杆菌和1.3×10⁵cfu／ml糞鏈球菌，震蕩混勻，取100分別塗布HKListeria、CHROMagarListeia和OXA平板，以10^-3～10^-8 純菌液塗布TSA-YE做對照，37℃培養36 h，計數單增李斯特菌菌落數，比較在幹擾菌株濃度較高而目標菌較低時各培養基的靈敏度。

1.5.4 人工汙染樣品

1.5.4.1 純菌汙染樣品檢測：將單增李斯特菌梯度稀釋後，取10-3—10-8“菌液各1 ml，分別加入到10 g豬肉和9 ml牛奶中，均勻混合2 h。按國標GB47893—33方法增菌，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培養基，37℃ 培養24 h，觀察單增李斯特菌在各培養基上的檢出情況。

1.5.4.2 單增李斯特菌和非李斯特菌混合汙染樣品檢測：將單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢杆菌、大腸杆菌、沙門菌、糞鏈球菌近似等比例混合後，10倍梯度稀釋成10-3～10-8 不同濃度的混合菌液，各取1 m1分別加入到10 g豬肉和9 ml牛奶中，按國標GB47893—33增菌後，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培養基，37℃ 培養24 h，觀察單增李斯特菌在各培養基上的檢出情況。

1.5.4.3 單增李斯特菌、英諾克和非李斯特菌混合汙染樣品檢測：由於樣品中李斯特菌數量一般較少，約1—10 cfu／ml，而英諾克是單增李斯特菌的主要競爭菌，其他李斯特菌對單增李斯特菌影響不大，因此將單增李斯特菌和英諾克按100 cfu：10 cfu、10 cfu：10 cfu和10 cfu：100 cfu 3種近似比例混合，然後加入(10⁴ -10⁵ )cfu／ml金黃色葡萄球菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml蠟樣芽孢杆菌、(10⁴ -10⁵)cfu／ml大腸杆菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml沙門菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml糞鏈球菌，製成混合菌液，分別加入到9 ml牛奶和10 g豬肉中，按國標GB47893— 33法，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，37℃培養24 h，觀察單增李斯特菌在各培養基上的檢出情況。

1.5.5 實際樣品 從市場購買實際樣品共62份，按國標GB4789—33增菌，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，觀察李斯特菌的檢出情況。

1.6 分離鑒定

將疑似菌落進行純化，用法國生物梅裏埃公司API Listeria試劑條，並結合傳統生化鑒定方法進行鑒定。

2 結果

2.1 顯色培養基的特異性

顯色培養基特異性檢驗結果如表1。HKListeria、CHROMagar Listeia具有較好的特異性，單增李斯特菌呈現藍色帶白色暈環的菌落，威爾和英諾克李斯特菌呈現藍色無暈環菌落；金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢杆菌在CHROMagar Listeia上略有生長，呈現綠色無暈環菌落，菌落形態與單增李斯特菌也有明顯區別；在上述兩種顯色培養基上大腸杆菌和沙門菌等革蘭陰性菌均被抑製。與顯色培養基相比，OXA、MMA特異性較差，不能特異區分單增李斯特菌。

表1 不同菌株在各種培養基上的生長情況

2．2 顯色培養基靈敏度檢測結果

單增李斯特菌10^-4、10^-5、10^-6 純菌液在各培養基上的生長情況如表2。對各培養基上的菌落數進行方差分析，P>0.05，表明HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE對單增李斯特菌的檢出率無顯著差異，其靈敏度相當；單增李斯特純菌10^-3-10^-8 菌液混合金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢杆菌、大腸杆菌和糞鏈球菌後，塗布平板的結果如表3。方差分析結果表明，P>0.05，4種培養基的靈敏度相當，當有高數量雜菌存在時同樣可以達到相同的檢測限。

表2 單增李斯特菌在各個培養基上的生長情況(Mean±Sd)

表3 非李斯特幹擾菌存在下各培養基上單增李斯特菌數(Mean±Sd)

TSA—YE上為單增李斯特菌純菌液的塗布結果(對照)

上一篇：顯色培養基在檢測食品中沙門菌的應用研究

下一篇：顯色培養基在單核細胞增生李斯特菌快速檢測中的應用研究（2）