細菌菌落總數檢測常見誤差原因分析

細菌菌落總數是微生態製劑樣品檢測必做的一項指標。菌落總數檢測同其他檢驗一樣，也存在檢測誤差。平板計數法是檢測飼料中細菌總數、活酵母數、芽孢杆菌數及乳酸菌數的常用方法之一，因此，該值準確與否直接關係到微生物飼料添加劑類產品的質量好壞。微生物平板計數的通常方法為每個樣品用 3個稀釋度，每個稀釋度常做 3個重複。但如何對平板菌落進行正確計數、3個稀釋度以哪一個稀釋度進行計數及微生物檢測允許誤差等問題，在飼料標準中並未有所規定，而這些問題與統計值的準確性密切相關。我們就實際檢測芽孢杆菌工作中遇到一些菌落計數的問題，與大家進行探討。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品：隨機抽取微生態飼料添加劑合生素樣品3份。

1.1.2 培養基：營養瓊脂。

1.1.3儀器設備：磁力攪拌器，無菌培養皿，培養箱，振蕩器。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品的振蕩時間對菌數檢測的影響

選擇1個樣品，稱取10 g，放入無菌錐形瓶內，加入90 mL無離子水，磁力攪拌分別為l0、20、30、40和60 min。

用1 mL移液槍從中吸取1 mL樣品懸濁液加入到盛有9 mL去離子水的試管中，用振蕩器使樣品充分均勻，以此類推，製成10^-1～1O^-7不同稀釋度的樣品溶液。

平板塗布法檢測菌含量：用移液槍從樣品稀釋液中各吸取200uL，每個樣品稀釋液3個重複；將平板倒置於35-37℃培養箱中培養24 h。

1.2.2 檢測方法對菌數檢測的影響

各個樣品稱取l0 g，放入無菌錐形瓶內，加入90 mL無離子水，磁力攪拌分別為40 min。並稀釋成10^-1～l0^-7 不同稀釋度的樣品溶液。

傾注平板法檢測菌含量：用移液槍從各個平行樣品相應稀釋液中各吸取1 mL，每個樣品稀釋液3個重複，待培養基表麵幹燥後，將平板倒置於35-37℃培養箱中培養24 h。

平板塗布法檢測菌含量：用移液槍從各個平行樣品相應稀釋液中各吸取200uL塗布平板，每個樣品稀釋液3個重複；將平板倒置於35～37℃培養箱中培養24 h。

2結果

2.1樣品的振蕩時間對菌數檢測結果的影響

采用細菌平板計數的方法，不同振蕩時間對合生素中芽孢杆菌檢出量的結果見表1。從表l中可見：不同振蕩時間獲得的細菌菌落數量有較大差別。總體而言，在一定時間內，隨著振蕩時間的延長檢出有效菌含量增加，說明細菌從載體上解析需要一定的時間；當振蕩時間為40 min後產品中的菌含量基本穩定。采用適當振蕩時間才能更精確的顯示產品中有效菌的含量。

表1 震蕩時間對有效菌含量結果的影響  億CFU／g    

2.2 檢測方法對菌數檢測結果的影響

表2 檢測方法對有效菌含量結果的影響 億CFU／g

采用不同的檢測方法，對合生素中芽孢杆菌檢出量的結果見表2。從表2可見：不同方法獲得的細菌菌落數量有差別，傾注平板法相較平板塗布法檢測的菌含量多，但基本在20％誤差範圍內。平板計數法操作相對簡單、快捷且影響因素較少。傾注法培養基營養分布較均勻，對部分蔓延菌落能控製，但對操作人員熟練程度要求相對較高。

3分析與討論

3.1樣品處理對結果的影響

取樣時對樣品取樣口和取樣工具要消毒，防止樣品交叉汙染。

3.2樣品的均質處理對結果的影響

固體樣品要用均質器或玻璃珠等充分均質，也可在稀釋液中添加相應溶解液（如吐溫80和液體石蠟等）的稀釋液，以保證樣品的充分均質。

測定芽孢杆菌活菌數時，不同振蕩時間獲得的細菌菌落數量有較大差別，因為細菌從載體上解析並均勻分散到溶液中需要一定的時間，待測樣品應在振蕩器上充分振蕩，使得芽孢杆菌可以充分和均勻地分散到待測溶液中，避免因為菌體未完全釋放而引起結果中細菌含量偏低的現象。

3.3 試驗過程中操作方法的影響

加樣l mL時，用1 mL的吸管並且每做一個稀釋度都要換1支吸管，否則稀釋度間菌落計數誤差會超過10％，說明存在操作誤差。用吸管向平皿裏加樣，平皿開口要小，吸管要直立且加樣結束後，讓吸頭接觸皿底幹燥處，保證加樣的體積不少。

若采取傾注平板法時，平皿加樣後要及時傾注瓊脂，其間隔一般不超過20 min （最好在10 min內)。以瓊脂不燙手(約45℃)為宜，否則會殺滅細菌，太熱也會使冷凝水過多，影響細菌的生長。加入瓊脂要及時搖勻，先向一個方向旋轉，然後向另一方向旋轉。這樣會減少菌落的集聚和連片現象。另外，用力不要過大，使瓊脂不濺到皿壁和皿蓋上，保證計數結果的準確。當瓊脂凝固後，要及時移入培養箱倒置培養。若采用塗布平板法進行檢測，放置適當時間後，則立即將平皿翻轉後放置培養箱中進行培養，以避免菌落蔓延生長，難以計數。

為保證結果準確，除作瓊脂的空白對照外，還要對菌落計數的全程做一對照。

3.4 菌落計數誤差

菌落計數在完成培養後應立即進行，以防菌落繼續生長蔓延從而影響測定結果。培養基中加入TTC（氯化三苯四氮唑)可使細菌菌落顯紅色，這樣可與同樣品顆粒和凝集物(白色)相區分，以提高菌落計數的準確性。有學者認為：100 mL培養基中加入2～3 mL的TTC可使菌落著色且不抑製細菌的生長。

菌落計數時要2個人分別用菌落計數器計數菌落總數，取2個人的平均數報告菌落總數。

一般來說，每平板含20～200個菌落的稀釋度的菌含量與實際結果最接近，超過200個／平皿或小於2O個／平皿的計數結果則可能與實際存在較大差別。因此，應盡量選擇20～200個／平皿的稀釋度進行芽孢杆菌的計數，保證菌落計數的有效性。報告結果要遵守國標中菌落計數的方法進行。

4小結

菌落數檢測的誤差可能來自於多個方麵。試驗研究表明：除了檢測環境和培養基之外，誤差主要來自於樣品和檢驗的操作過程，包括檢驗的準備環節。一般認為，微生物樣品不能複檢。但當菌落總數在標準的臨界或菌落出現明顯的異常時，有時重新檢測還是必要的。這裏所提到的重新檢測是對同一批次未開封且保存的時間和溫度都比較合適的樣品。這樣，可以通過重新檢測校正誤差。

作者：孫笑非 李超

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