吡咯類抗真菌藥物製劑微生物限度檢查方法的研究

    [摘要] 目的：研究建立吡咯類抗真菌藥物製劑的微生物限度檢查方法。方法：通過預試驗摸索，擬以含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作為稀釋劑及衝洗液，采用離心沉澱集菌法與薄膜過濾法聯用的方法進行此類藥物的微生物限度檢查並進行方法學驗證。結果：按《中國藥典》2005年版附錄要求對擬定方法進行驗證，結果驗證菌株的回收率均大於70%，控製菌檢查陽性菌也生長良好。結論：以含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作為稀釋劑及衝洗液，采用離心沉澱集菌法與薄膜過濾法聯用進行吡咯類抗真菌藥物製劑的微生物限度檢查，方法是可行的。

　　[關鍵詞] 吡咯類抗真菌藥物製劑；微生物限度檢查；離心集菌法；薄膜過濾法

　　[Abstract] Objective：To establish a method of microbial limit test on the antifungal drug of piromidic. Methods：According to the result of test beforehand, we used the histidine,lecithin,Tween 80 mixed solution as the diluent and lotion. The methods of contrifugal precipitation and membrance filtration were used for collecting bacteria and validation of microbiological test. Results: The ratio of recoveries of five germs were bigger than 70%, and the requirement of the Pharmacoeia of China (ChP) 2005 were reached. Conclusion: The method is suitable to the microbial limit test for the antifungal drug of piromidic.

　　[Key words] Antifungal drug of piromidic;Validation of microbiological test; Centrifugal precipitation; Membrane filtration methods

　　吡咯類抗真菌藥，如硝酸布康唑和克黴唑，具廣譜抗真菌活性，對表皮癬菌、毛發癬菌、曲菌、著色真菌、隱球菌屬和念珠菌屬均有較好的抗菌活性。該類藥物通過幹擾細胞色素P-450的活性，從而抑製真菌細胞膜主要固醇類-麥角固醇的生物合成，損傷真菌細胞膜並改變其通透性，導致重要的細胞內物質外漏，還可抑製真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成，抑製氧化酶和過氧化酶的活性，引起細胞內過氧化氫積聚，導致細胞亞微結構變性和細胞壞死。此類藥物對細菌也有一定的抑製作用。根據目前國內要求，非規定滅菌的藥物製劑均需建立微生物限度檢查方法，包括抗細菌和抗真菌類藥物製劑，但由於此類藥物抗菌活性很強，因此如何消除其抑菌性，使檢驗得以順利進行就成為建立方法時極為重要也是較為困難的關鍵點。本文作者選擇目前在國內還沒有適宜微生物限度檢查方法的吡咯類（如硝酸布康唑和克黴唑）抗真菌藥物製劑進行了試驗研究，經多次試驗，重點對衝洗液組成和衝洗量進行考察研究和優選，最終參考《歐洲藥典》確定了以含有組氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作為稀釋劑及衝洗液，采用離心沉澱集菌法與薄膜過濾法聯用，從而建立了硝酸布康唑類和克黴唑類藥物製劑的微生物限度檢查方法，並進行了方法學驗證，結果表明該方法是適宜可行的。

　　1試藥與儀器

　　1.1試藥

　　硝酸布康唑陰道乳膏3批，克黴唑陰道片2個廠家各3批，複方克黴唑乳膏3批，克黴唑乳膏3批，醋酸米康唑乳膏3批，均為市售藥品；營養肉湯培養基，改良馬丁培養基，營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，膽鹽乳糖培養基，溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基，均購自中國藥品生物製品檢定所；組氨酸、卵磷脂、聚山梨酯80、蛋白腖、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為市售分析純試劑、試藥；金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]，大腸埃希菌[CMCC(B)44102]，銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]，白色念珠菌[CMCC(F)98001]，黑曲黴[CMCC(F)98003]，以上菌種均購自中國藥品生物製品檢定所菌種室，按照《中國藥典》2005年版附錄的要求將以上5種驗證菌配製成每1 ml中含菌量為50~100 cfu的菌液。

　　1.2儀器

　　潔淨工作台，醫用吸引器，低速離心機等。

　　2方法與結果

　　2.1藥典附錄收載方法試驗的結果

　　將上述各藥品用《中國藥典》2005年版推薦的常用稀釋劑pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液製成1∶10的供試液，依次采用藥典附錄收載的幾種消除藥物抑菌性的處理方式，即培養基稀釋法（取1∶10的供試液按每皿0.2 ml或取1∶100的供試液按每皿0.2 ml注皿）、離心沉澱集菌法和以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液為衝洗液的薄膜過濾法、以及將離心沉澱集菌法與薄膜過濾法聯用進行菌落計數試驗。其中，以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液為衝洗液，衝洗總量已達1 000 ml的離心沉澱集菌法與薄膜過濾法聯用試驗回收率測定結果見表1。

　2.2回收率測定

　　即使采用了處理力度較大的離心沉澱集菌法與薄膜過濾法聯用，５種驗證菌株中仍有4種回收率為零，說明吡咯類抗真菌藥物具有很強的抑製細菌和真菌的作用，或說明濾膜對此類藥物有較強的吸附作用，目前常用的衝洗液很難將其衝洗幹淨，國內常用的幾種處理方式均不適用於此類藥品。

　　2.3不同配方稀釋劑與衝洗液的效果比較

　　參考《中國藥典》2005年版[1]、《歐洲藥典》第5版[2]，配製了下列5種稀釋劑與衝洗液，詳見表2。

選用一批克黴唑陰道片，依次試驗上述5種稀釋劑與衝洗液，采用離心沉澱集菌法與薄膜過濾法聯用，比較實驗效果，詳見表3。

上述結果表明，采用歐洲藥典配方溶液且卵磷脂為進口試劑，或采用自擬5號溶液作為稀釋劑與衝洗液均對消除藥品的抑菌性效果較為滿意，但當卵磷脂改為國產試劑時，由於溶液呈混濁狀，無法進行過濾。將卵磷脂和聚山梨酯80的量降為歐洲藥典配方量的一半時，溶液澄清度可不受試劑質量影響，同時衝洗效果也可滿足實驗要求。2.4建立的方法

　　2.4.1根據上述試驗結果建立方法取供試品10 g，加入含有無菌組氨酸-卵磷脂-聚山梨酯80的混合溶液（配製方法見後）至100 ml，在45℃保溫振搖至供試品分散均勻，製成1∶10的均勻供試品儲備液。細菌計數、黴菌和酵母菌計數均采用離心沉澱集菌法與薄膜過濾法聯用。取1∶10的供試品儲備液50 ml，以500 r/min的速率離心5 min，取全部上清液，加上述混合溶液至50 ml，再以3 000 r/min的速率離心20 min，取底部集菌液約5 ml，加上述混合溶液至50 ml，即為1∶10的供試液（乳膏等製劑可略去沉澱步驟）。取1∶10的供試液1 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過濾器全部過濾，以上述混合溶液作為衝洗液，每次衝洗100 ml，共衝洗3次，取濾膜，依法檢查（《中國藥典》2005年版二部附錄Ⅺ J）。

　　2.4.2控製菌檢查（如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等）采用離心沉澱集菌法與薄膜過濾法聯用。取上述菌落計數項下1∶10的供試液10 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過濾器全部過濾，衝洗方式同菌落計數項下，將濾膜接種至相應的培養基中，依法檢查(《中國藥典》2005年版二部附錄Ⅺ J)。

　　2.4.3無菌組氨酸－卵磷脂－聚山梨酯80混合溶液配製方法聚山梨酯80 15 g，卵磷脂1.5 g，組氨酸0.5 g，蛋白腖0.5 g，氯化鈉2.15 g，磷酸二氫鉀1.8 g，磷酸氫二鈉3.6 g，水1 000 ml，混勻，微溫溶解，分裝，滅菌。

　　2.5驗證試驗

　　按照《中國藥典》2005年版附錄要求對上述建立的方法進行驗證。

　　2.5.1細菌計數、黴菌和酵母菌計數方法的驗證菌液組：分別取上述5種菌液各1 ml，采用平皿計數法，測定製備好的菌液中每毫升的活菌數。供試品對照組：取1∶10的供試液1 ml，加入上述混合溶液100 ml，用薄膜過濾器全部過濾，衝洗方式同上，取濾膜，置規定溫度培養、計數。試驗組：取1∶10的供試液1 ml，按供試品對照組同法操作，在第三次衝洗液中加入1 ml上述菌液（50~100 cfu試驗菌），取濾膜，置規定溫度培養、計數，計算回收率，見表4。稀釋劑對照組：分別取上述5種菌液各10 ml（500~1 000 cfu試驗菌），按供試品對照組同法操作，計算回收率，見表4。按下列公式計算回收率(%)：

　　上述實驗顯示，各驗證菌的回收率均達到藥典附錄要求，表明該類藥品采用此法進行細菌、黴菌和酵母菌計數是可行的。

　　2.5.2控製菌檢查方法的驗證試驗組：取上述1∶10的供試液10 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過濾器全部過濾，衝洗方式同上，將濾膜加至相應培養基100 ml中進行增菌培養，作為供試品組。空白對照組：取上述混合溶液10 ml，同法操作，作為稀釋劑空白對照組。陰性菌對照組：取1∶10的供試液10 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過濾器全部過濾，衝洗方式同上，但在第3次衝洗液中加入適宜的陰性對照菌（如金黃色葡萄球菌檢查就選用大腸埃希菌作為陰性對照菌）10~100 cfu，將濾膜加至相應培養基100 ml中作為陰性菌對照組。陽性菌對照組：取1∶10的供試液10 ml，加至上述混合溶液100 ml中，用薄膜過濾器全部過濾，衝洗方式同上，但在第3次衝洗液中加適宜的菌（如金黃色葡萄球菌檢查就加入金黃色葡萄球菌）10~100 cfu，將濾膜加至相應培養基100 ml中作為陽性菌對照組。

　　上述各組均置35～37℃培養18～24 h，分別劃線於相應培養基上，再置35～37℃培養18～24 h，結果陽性菌對照組均生長良好，表明該類藥物經此法處理後已無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計；陰性菌均未檢出，表明該控製菌檢查方法的專屬性好，說明方法可行。

　　3討論

　　本實驗研究說明吡咯類藥物對細菌和真菌同時具有很強的抑菌作用，對於這類具有較強抗菌活性的藥物必須首先摸索處理方式來消除其抑菌作用，然後方能順利進行其微生物限度檢查。

　　若采用薄膜過濾法進行藥品的微生物限度檢查，選用的稀釋液和衝洗液的種類和用量非常重要，甚至可以決定方法的適用與否。作為微生物限度檢查用稀釋液和衝洗液，不單應具有溶解藥物的功能，同時還應具有維持菌體細胞膜的通透性、修複受損細胞、破壞藥物對菌體細胞損傷等作用。本實驗確定的衝洗液的處方中組氨酸是白色念珠菌生長中重要的氮源之一；卵磷脂對於細胞膜的修複可起到重要的作用；聚山梨酯80作為一種表麵活性劑，可降低細菌體周圍與培養基接觸麵之間的表麵張力，使外圍營養物質更快地進入細胞內，因而促進細菌較快的生長和其他活動。卵磷脂和聚山梨酯80配合使用可中和抑菌劑，中和後的產物對細菌及培養基無太大影響，因此在稀釋液和衝洗液中加入這些物質可有效的降低藥品對細菌和真菌的抑製作用，同時促進受損的細菌和真菌生長。

　　某些國產試劑、試藥與進口品存在一定的質量差異，《歐洲藥典》收載的衝洗液配方中卵磷脂及聚山梨酯80的含量較多，當用國產品配製時，其溶解性能不好，造成溶液混濁，衝洗量大時，溶液過濾的速度緩慢，影響衝洗效果，甚至無法進行過濾。該問題通過降低配方中各成分的量可以得到有效解決。經驗證，即使配方中的各成分量減少一半，效果依然可滿足實驗的需要，且過濾速度適宜，還可降低實驗成本。

作者：劉文傑　江誌傑　餘　立　高　春　王似錦

[參考文獻]

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:化學工業出版社,2005. 附錄93.

[2]歐洲藥典[S].第5版.Appendix XVI B.A377.

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