關鍵詞： 多糖； 微生物； 藥用； 生物活性
Advances in the research of active polysaccharides derived from microbes
ABSTRACT Over the past few years, many advances have been made toward research on active polysaccharides especially microbial polysaccharides, it becomes a hot spot in new drug research and development. This review will focus on recent studies that illustrate the biological activities, mechanisms of action and structurefunction relationships of microbial polysaccharides for drug use.
KEY WORDS Polysaccharide; Microorganism; Drug use; Biological activities
多糖廣泛分布於高等植物、地衣、海藻、動物和微生物中。微生物來源的多糖是至今研究得比較詳細的一類多糖，其廣泛的生物活性使得其已成為微生物藥物一個重要的組成部分，且在新藥研發中越來越受到重視。本文對迄今為止所發現的微生物多糖的藥用生物活性進行了綜述，並總結了近年來關於多糖構效關係和作用機理方麵的研究成果。
1 免疫調節功能
免疫調節劑在疾病治療中的作用越來越受到重視。多糖免疫調節劑於40餘年前被首次發現，近二十年來，有更多微生物來源的多糖被確認對機體免疫反應的調節有著極為重要的意義。這些多糖的免疫調節作用涉及到免疫係統的各個方麵，對於其免疫調節機製的研究也體現在各個層次上，對這些多糖分子決定它們與宿主免疫係統相互作用的結構特征也已經進行了更為深入的研究。以下對幾種比較典型的免疫調節劑分別進行介紹。
1.1 兩性離子多糖 兩性離子多糖(zwitterionic polysaccharides,Zps)是有同時含有陽離子和陰離子結構以實現其生物功能的一類多糖。多糖A(PS A)是Zps的分類原型。PS A是從革蘭陰性厭氧菌脆弱擬杆菌中分離得到的兩種莢膜多糖中的一種。Zps在菌體表麵組裝成莢膜多糖複合物(CPC)。早期研究證明，CPC能調節腹腔內膿毒症伴隨性膿腫的形成［1］。CPC的腹膜內給藥能誘導膿腫形成，而皮下和肌肉的預防性給藥則能防止宿主在細菌感染後形成膿腫。一方麵，在誘導膿腫形成過程中，Zps扮演了多重角色，它能誘導細菌在腹腔間皮表麵的粘附，並能刺激某些促免疫細胞因子和化學增活素，進而誘導宿主細胞CAMs的表達，完成腹腔內多形核白細胞的募集。另一方麵，Zps預防膿腫形成、保護機體免於免疫反應的作用，並非是作為一種經典的免疫原去介導特異性的免疫反應，而是對宿主的免疫係統進行調節，從而對導致膿腫形成的免疫反應實現全麵抑製。其具體機製是Zps對CD4+T細胞活性和IL2生成的調節［2］，而IL2似乎是Zps調節機體免疫以預防膿腫的中心環節［3］。對於其構效關係的研究表明，Zps同時含有陰陽電荷基團的重複單元是其免疫調節作用的關鍵性結構，破壞多糖的電荷結構能使其活性顯著降低［4］。
1.2 β(13)葡聚糖從酵母和真菌中純化得到的β(13)葡聚糖是另一類免疫調節劑。沿著β(13)葡聚糖主鏈隨機分布著β(16)葡聚糖基支鏈。Williams等證明β(13)葡聚糖能顯著增加動物體內嗜中性粒細胞水平並增加骨髓細胞的增殖。PGG是Williams研究組經高度純化已獲專利的一種β(13)葡聚糖。PGG給藥後，嗜中性和嗜酸性粒細胞的比例增加，從給藥小鼠體內得到的嗜中性粒細胞，在體外對大腸埃希菌的吞噬作用增加［5］；巨噬細胞的形態發生改變，巨噬細胞同時表現出磷酸酶活性增加和脂多糖(LPS)刺激的NO生成的特征［6］。研究表明，β(13)葡聚糖能調節淋巴細胞和單核細胞中促免疫細胞因子的產生［7］。β(13)葡聚糖對NFκB樣和NFIL6樣轉錄因子的調節作用具有時間和濃度依賴性［8］。其所涉及的信號轉導通路與超抗原LPS不同。PGG用於預防治療也獲得了肯定的實驗結果。能顯著降低腹腔內膿毒症的致死率。Williams在膿毒症小鼠模型試驗中研究了β(13)葡聚糖對轉錄激活、細胞因子表達的影響，發現與對照動物相比，NFκB和NFIL6的核結合活性降低，TNFα和IL6的mRNA水平也有所下降。轉錄因子活性和細胞因子表達的下調和敗血症動物的存活率升高是正相關［10］。β(13)葡聚糖的免疫調節生物活性基於它們與巨噬細胞和多形核中性粒細胞(PMNs)的直接作用。Muller等的工作表明，磷酸葡聚糖，一種水溶性的(13)βD葡聚糖，能夠與人或鼠的單核/巨噬細胞結合。這種結合特異地導致了外來細菌的內在化和增加的胞漿空泡化［11］。β(13)葡聚糖的免疫調節還涉及到補體途徑。補體受體3(CR3)也已經被確認是某些葡聚糖的受體［12］。CR3介導的吞噬作用和脫顆粒作用需要CR3結構域上一個iC3b結合位點和一個葡聚糖結合位點同時與配基的結合。用抗PGG葡聚糖受體的單克隆抗體對中性白細胞處理，可以抑製NFκB樣因子的激活［13］。將酵母菌株煮沸和酶處理得到可溶和不可溶的葡聚糖粗品。不可溶的葡聚糖可通過磷酸化、硫酸化和氨基化等方式進行衍生化修飾以提高其溶解性。可溶性葡聚糖在水溶液中主要以線形的三螺旋結構存在。研究表明，糖鏈的螺旋結構構象是其生物活性存在的必要條件，而糖鏈中的親水性基團(多羥基)應位於螺旋體的表麵［14］。微粒酵母葡聚糖的免疫調節活性還受其分子量和β(16)糖苷鍵數目的影響。同樣的情況也發生在其他的一些β(13)D葡聚糖上，如真菌多糖pestalotan等。另外，支鏈長度也會影響多糖的活性。從真菌Phytophthoraparasitica中分離得到的活性β(13)D葡聚糖，其具有葡聚三糖支鏈的組份，活性大大高於具有葡聚二糖支鏈的組分［16］。
1.3 甘露聚糖從白念珠菌中分離得到了有一定免疫調節活性的甘露聚糖。巨噬細胞遞呈的甘露糖結合凝集素(MBL)能與甘露聚糖結合，並通過一種非自身識別機製激活宿主免疫係統。甘露聚糖包裹感染性抗原並介導了內吞和吞噬作用，甘露聚糖受體識別多糖裏的一個重複單位，這種識別導致了細胞信號轉導、細胞因子產生和補體的激活。研究表明，白念珠菌甘露聚糖在皮下注射給藥後對宿主的免疫抑製作用與用藥後遲發型超敏反應被抑製有關［17］。IL4是介導甘露聚糖特異性誘導免疫下調的關鍵性細胞因子。另外也有研究表明，IL12p40、IL10和IFNγ對CD+T細胞(下調效應細胞)的產生也有一定作用［18］。
1.4 蛋白結合多糖從真菌蘑菇中分離得到了蛋白結合多糖PSK和PSP。這些化合物在結構上比較相近，分子量約為100kDa［19］。其單糖間以α(14)和β(13)糖苷鍵連接，蛋白部分則以天門冬氨酸和穀氨酸為主，蛋白含量約為15%。這類多糖能夠抑製體外腫瘤細胞係的生長並具有體內的抗腫瘤活性。對食道癌、胃癌、肺癌、卵巢癌和子宮頸癌等有肯定的防治效果。這類多糖的免疫調節作用機製尚不清楚。有研究表明，小鼠在PSK給藥處理後，PSK能結合並抑製免疫抑製細胞因子TGFβ［20］。PSK還能夠激活嗜中性粒細胞，這些可能是PSK抗癌活性的部分原因。PSK和PSP是生物反應調節劑，能刺激T細胞的激活和誘導IFNγ和IL2的生成。也有研究發現PSK和PSP能增強小鼠體內的超氧化物歧化酶(SOD)的活性［21］。
1.5 透明質酸透明質酸(HA)可以由鏈球菌產生，同時也是組成哺乳動物組織胞外基質的一種主要的糖類成分，在皮膚、關節、眼和大多數其它的器官和組織中都有存在。透明質酸是一個二糖的重複。該二糖是一種最簡單的陰離子氨基葡聚糖。透明質酸是通過與真核細胞CD44受體的結合來完成對免疫係統的調節作用。這種配體受體間的相互作用對於T細胞胞間通信和白細胞外滲的調節是至關重要的［22］。低分子量HA則可被用於阻斷T淋巴細胞CD44和真核細胞來源HA之間的相互作用。這在臨床上可被用於防止同種異體移植的排斥反應以保護機體器官的功能。另外，HA能促使創傷愈合，並能在眼睛和關節外科中被用作人體HA的替代品［9］。
2 抗腫瘤活性微生物
多糖的抗腫瘤活性多與其免疫調節功能密切相關。多糖能激活免疫細胞，並誘導多種免疫細胞因子和細胞因子受體基因的表達，增強機體的抗腫瘤免疫力。從擔子菌門真菌中得到的香菇多糖、裂褶多糖、雲芝多糖、茯苓多糖等抗腫瘤多糖，在國內外臨床上已普遍應用，都具有上述免疫調節劑的特征結構。從香菇子實體和深層發酵菌絲體中得到的兩種具抗腫瘤活性的多糖分別為β(13)葡聚糖和含少量肽的α甘露糖。雲芝多糖PSK則具有蛋白結合多糖結構。裂褶多糖和茯苓多糖也是β(13)葡聚糖，但當茯苓多糖含有β(16)葡聚糖側鏈時沒有活性，而用高碘酸鹽氧化反應將側鏈除去後，卻表現出顯著的抗腫瘤活性。免疫調節多糖的抗腫瘤作用需要宿主免疫係統的參與，但有些微生物多糖在體外也表現出對腫瘤細胞生長的抑製作用。除了免疫調節外，近年來對多糖抗腫瘤活性的其它作用機製也有所研究。主要有以下幾個方麵［23］：(1)影響細胞的生化代謝：茯苓多糖對肉瘤S180細胞的增殖有抑製作用，可導致S180細胞膜唾液酸(SA)含量增加，而膜磷脂、花生四烯酸和豆蔻酸的含量下降，細胞膜的PI轉換被顯著抑製，影響了腫瘤細胞轉移和相關抗原的表達。香菇、豬苓、茯苓多糖能抑製人早幼粒細胞白血病HL60細胞酪氨酸蛋白激酶(TPK)的活性，激活磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPP)，可降低細胞酪氨酸蛋白的磷酸化程度；(2)影響細胞周期：某些多糖可能作用於腫瘤細胞的細胞周期。Kamei等將雲芝多糖與結腸癌細胞AGS一起培養4d後，腫瘤細胞的數量比對照組明顯減少，流式細胞術檢測表明，腫瘤細胞的生長被阻滯於S期和G2/M期［15］。(3)抗氧化作用：機體內過量的超氧化自由基和脂質過氧化物(LPO)對DNA的持續損傷，會導致細胞的癌變。動物和臨床試驗表明雲芝多糖PSK能增強超氧化物歧化酶(SOD)的活性，緩解腫瘤宿主體內的氧化應激狀態。Kariya等在聯氨氧化反應體係中觀察到雲芝多糖有自由基清除劑作用，並通過電子自旋共振檢測，證明其有擬SOD的作用。又有報道雲芝多糖能增強正常小鼠和正常遲發型超敏感性(DH)小鼠淋巴細胞、脾及胸腺中SOD的活力，而對腫瘤組織中SOD則有明顯的抑製作用。(4)其它：香菇、雲芝和靈芝等多糖均能抑製鼠肝細胞對致癌物苯並芘的吸收。香菇多糖能使腫瘤部位的血管擴張和出血，造成腫瘤組織壞死。有些微生物來源的多糖與腫瘤細胞表麵的糖類分子很相似，能抑製腫瘤細胞的粘附，從而抑製了腫瘤細胞的侵襲與轉移［24］。
3 抗病毒活性
多糖的抗病毒作用已引起醫藥界的高度重視。尤其在抗HIV方麵，硫酸酯化多糖因為其活性明確，已成為近年來的研究熱點［26］。研究表明，其作用機製除了多糖的免疫激活作用外，該類聚合物可以通過阻斷HIV病毒gp120與宿主細胞CD4受體的結合而發揮作用，這可以阻斷病毒對宿主細胞的吸附，防止合細胞的形成［25］。某些硫酸多糖還能夠抑製HIV逆轉錄酶活性，硫酸化側鏈與RNA模板引物上的某些酶有相同的結合位點，從而產生競爭性抑製作用。最近的研究又發現，硫酸多糖與HIV1反式激活因子tat的結合能阻止tat蛋白進入胞內，使HIVLTR的轉錄激活受到抑製，從而抑製了HIV1的複製和整合。硫酸多糖的抗病毒活性首先源於其聚陰離子特性，因此硫酸基團是該類多糖活性的必要條件。分子中硫酸基團的含量越高，其抗HIV的作用越強。但硫酸根過多會產生抗凝血等不良反應［27］。硫酸基團分布的空間構象對抗病毒活性也有影響，如Tat蛋白與肝素的結合要求至少有2O、6O和N位置的硫酸化［28］。糖鏈柔性的降低能升高硫酸多糖的抗病毒活性。分子大小是多糖抗病毒活性的另一個影響因素。硫酸葡聚糖抗HIV的活性隨著相對分子質量的增加而增加，相對分子質量在1×104～5×105的範圍內能保持最大活性。除了抗HIV外,多糖對其他類型病毒也有抑製作用，如單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV1，HSV2)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、流感病毒(Influenza virus)、囊狀胃炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)等［29］。香菇多糖具有抗腫瘤作用，硫酸酯化後則具有顯著的抗艾滋病作用，在濃度為100mg/L時能完全抑製RT活性，10～100mg/L時能抑製合體細胞的形成，10mg/L時能強烈抑製HIV抗原的合成，並能保護被HIV感染的MT4細胞。但硫酸酯化後的多糖卻失去了原有的抗腫瘤活性。由此推測硫酸酯化多糖和非硫酸化多糖的免疫調節作用機製是不同的。通過13CNMR、苯胺藍熒光法及粘度法測定證明，硫酸基團的引入造成多糖理化性質及其空間立體構象的變化，而這正是多糖活性的決定因素。
4 其它活性
多糖的免疫調節功能使其在臨床上具有抗感染和抗炎活性。免疫調節劑的使用相對於常規藥物治療具有其獨特的優點。對宿主免疫係統的先天抗感染能力的增強可能會有效地解決抗生素耐藥的問題。吳倩等應用重組sIL1 RⅠ為靶點建立抑製劑篩選模型，從鏈黴菌的代謝產物中得到IL1的拮抗劑139A，動物模型的研究表明它們具有抗類風濕性關節炎的作用［30］。對139A生物合成中引導糖基轉移酶基因的克隆和鑒定工作也已經完成［31］。對中藥植物多糖降血糖活性的研究較為普遍，近年來，從微生物中也發現了一些有明顯降血糖作用的多糖。從Cordyccps sinensis中提取得到的多糖CSF10能增強葡萄糖激酶活性，加速葡萄糖的代謝；並可以降低GLUT2蛋白水平從而抑製肝髒葡萄糖的輸出，最終達到降低血糖的目的［32］。另外，發現某些微生物來源多糖(如銀耳多糖)和一些多糖的硫酸化衍生物，具有肝素樣抗凝血作用，其抗凝活性與多糖分子量和硫酸化程度相關；木耳多糖、銀耳多糖等對血栓的形成有抑製作用，這可能與它們降低血栓纖維蛋白原含量，降低血小板數目及其粘附力的能力有關；香菇多糖可促進膽固醇代謝而降低血清膽固醇含量，從而達到降血脂的目的；靈芝多糖能抑製人嗜中性粒細胞自發和Fas介導的細胞凋亡，這與抗衰老活性相關；靈芝中的一種小分子多糖能增加蛋白和核酸的合成；而某些微生物多糖對RNase有抑製作用，可減少RNA降解，對RNA治療可起到協同作用。
5 結語
多糖類藥物具有多效性、低毒性、來源廣泛、天然綠色等優點，多糖與現有藥物的聯合用藥可以提高藥物的作用範圍和效力，減少用藥量，並可防止或推遲耐藥的出現。但由於多糖結構太複雜，所以不易控製其質量標準，結構測定及合成難度較大；缺乏明確的作用機製研究；而有些多糖在天然產物中含量很低且不易分離得到。這使它們在臨床上的應用受到限製。近年來，隨著結構分析技術的進步和作用機製研究的不斷積累和深入，人們對多糖如何作用於細胞因子網絡、協調生物學功能的結構特征有了更多的了解，發現了一些多糖的特異受體，為新活性化合物的開發提供了基礎。對於多糖構效關係的認識也更為豐富，為提高活性而進行的結構改造工作也有很大進展。多糖的結構研究是多糖研究中亟待解決的薄弱環節。在確保多糖純度的前提下，現有二維核磁技術的結合(如：COSY譜、NOESY譜、HOHAHA譜、TOCSY譜等)使我們有可能推導出部分多糖完整的一級結構［33］。而質譜由於其高度的靈敏性，在多糖尤其是極少量多糖的結構分析中，也發揮了越來越重要的作用，FABMS和液質聯用技術已越來越廣泛地用於多糖的結構分析中。多糖的高級結構分析也有所發展，但還無法做到像核酸和蛋白質結構測定那樣自動化、微量化和標準化。關於藥用微生物多糖生物合成的研究也逐漸開展起來。對這些微生物菌株進行的多糖合成基因分析發現有共同的操作子結構，暗示了這些多糖的生物合成擁有相同的分子機製。對於多糖合成基因簇及其生物合成途徑更深入的了解，能為進一步的組合生物學研究，以及最終獲得新結構多糖、改變天然多糖理化性質、提高多糖的活性和產量提供理論基礎。
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