顯色培養基快速檢測大腸菌群和大腸杆菌效果的研究

【摘要】 目的  評價大腸菌群(Coliform)和大腸杆菌(Escherichia coli)複合顯色培養基(CCEA)的檢測效果。

方法   本實驗室研究的顯色培養基CCEA與經典培養基結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基(VRBA)和國外兩種同類商品化顯色培養基(Agar I和Agar II)作對比，分別對11種質控菌株、添加大腸杆菌或大腸菌群的13種無菌樣品以及4種實際樣品進行檢測，對檢測結果進行統計分析，以及觀察對實際樣品檢測的符合率情況。

結果   CCEA具有良好的選擇性；對7種質控菌株檢驗結果的分析，CCEA與VRBA和Agar II比較無統計學意義；CCEA比Agar I長出菌落數略多，有統計學意義。對13種無菌樣品中添加大腸杆菌或大腸菌群檢驗結果的分析，CCEA比VRBA長出菌落數略多，有統計學意義；CCEA與Agar I和Agar II比較無統計學意義。對4種實際樣品中大腸菌群檢驗結果的分析，CCEA與VRBA、AgarI和Agar Ⅱ比較無統計學意義；大腸菌群經驗證總體符合率分別為90％ 、71.88％ 、86.25％和81.25％，即符合率大小為CCEA>Agar I>Agar Ⅱ>VRBA。對4種實際樣品中大腸杆菌檢驗結果的分析，CCEA與Agar I和Agar II比較無統計學意義；大腸杆菌經驗證總體符合率均為100％。結論本實驗室研究試製的顯色培養基CCEA優於經典培養基VRBA並與國外兩種同類顯色培養基Agar I和Agar II總體檢測效果無統計學意義。

【關鍵詞】培養基； 大腸杆菌； 腸杆菌科

大腸菌群是指一群在37℃培養24 h能發酵乳糖產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭陰性無芽胞杆菌，包括埃希菌屬(大腸杆菌)、肺炎克雷伯菌屬、檸檬酸杆菌屬和腸杆菌屬。大腸菌群主要來源於人畜糞便，故以它作為糞便汙染的指標。若食品中大腸群菌數量越多，表示受糞便汙染的程度越大，也就是受腸道中病原菌隨糞便侵入的可能性越大，所以大腸群菌的檢驗用以評價食品的衛生質量，具有廣泛的衛生學意義。經典的大腸菌群尤其是大腸杆菌的檢測方法存在檢測程序比較繁瑣、檢測周期長等缺點。顯色培養法是近段時間發展的一種檢測和鑒別細菌新技術，其原理是人工合成無色底物由產色基團和微生物可代謝物質兩部分組成，在特異性酶作用下遊離出產色基團顯示特定顏色，這種利用顯色底物來測定特殊酶的活性，可直接觀察菌落顏色即可對菌株做出鑒定。這種敏感的方法提高了檢測的速度和正確性，優於初期分離的培養基。省略了為鑒別而必須先分離出純培養物的過程，而且選擇合適的合成底物可實現對幾個不同生化反應進行同時檢測據報道，絕大多數大腸杆菌具有β-葡萄糖醛酸酶，大腸菌群具有β-半乳糖苷酶。依據此原理，本實驗室試製的大腸菌群和大腸杆菌顯色培養基(CCEA)，與國外兩種同類商品化顯色培養基(AgarI和AgarII)均含有β-D-半乳糖苷顯色底物和β-D-葡萄糖苷顯色底物，大腸菌群和大腸杆菌利用不同的酶分別分解這兩種底物，使不同色澤的色源遊離出來顯不同的色澤而區分大腸杆菌和其他的大腸菌群。這類顯色培養基在國外已經廣泛使用於食品中大腸菌群和大腸杆菌的同時快速檢測，並已得到FDA、AOAC等官方的認可。大量的文獻報道這種顯色法具有高的敏感性和特異性，操作簡便、快速，可大大節省人力和物力。為探討顯色法的實用價值，本實驗室研究試製了CCEA培養基，並用該培養基與國外同類商品化產品以及經典方法測試了有一定代表性的菌株和食物樣品，檢測效果不錯，現報告如下。

材料與方法

一、材料

1．培養基：大腸菌群和大腸杆菌顯色培養基(CCEA，每L含蛋白腖15 g、酵母膏粉3 g、氯化鈉5 g，十二烷基硫酸鈉0.1g，瓊脂12 g，混合色素6.77g，最終pH 7．0±0．2)、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)、國外顯色培養基(Agar I)、國外顯色培養基(Agar II)、乳糖發酵管、月桂基硫酸鹽胰腖(LST)肉湯、色氨酸肉湯(靛基質試驗)、Koser枸櫞酸鹽肉湯MR—VP培養基、營養瓊脂。

2．測試菌株：大腸杆菌(Escherichia coli)ATCC25922、E．coli ATCC8739 E．coli GIM1.42、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)廣臨檢-57、費氏檸檬酸杆菌(Citrobacter freundii)ATCC8090、產氣腸杆菌(Enterobacter aerogen)CMCC45103、陰溝腸杆菌(E.cloacae)CMCC45301、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)CMCC50115、糞鏈球菌(Streptococci faecalis)CMCC32223、金黃色葡萄球菌(Staphylococci aureus)ATCC6538、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GIM1.22。

3．無菌樣品(13種)：牛奶、果凍、芒果糕、方便麵、蛋糕、雞蛋、奶品、八寶粥、冰棍、餅幹、飲料、蘋果汁。

4．模擬樣品(無菌樣品中添加質控菌株)：牛奶+(E.coliATCC25922)、牛奶+(C.freundiiATCC8090)、果凍+ (K.pneumoniae 廣臨檢-57)、芒果糕+(K. pneumoniae 廣臨檢-57)、方便麵+(K.pneumoniae廣臨檢-57)、蛋糕+[E.coli ATCC8739+E.cloacaeCMCC(B)45301]、雞蛋+(E.coliATCC8739+E.cloacaeCMCC(B)45301)、奶品+ [E.coliATCC25922+E aerogenCMCC(B)45103]、八寶粥+(E coliGIM1.42+K. pneumoniae廣臨檢-57)、冰棍+(E.coliGIM1.42+K.pneumoniae廣臨檢-57)、餅幹+[E.cloacaeCMCC(B)45301]、飲料+[E.aerogeCMCC(B)45103]、蘋果汁+( K.pneumoniae廣臨檢-57)。

5．實際樣品(4種)：雞肉、豬肉、冰棍、冰淇淋。

二、實驗方法

1．測試菌株培養實驗：將上述11種菌種複蘇，分別挑取菌落置生理鹽水進行連續10倍遞減稀釋，選擇3個合適的稀釋度，各取1 ml，傾注法分別接種於上述4種培養基的平板上，各接種3個平板，37℃ ，培養24 h。

2．模擬樣品檢測實驗：按照GB／T 4789．2-2003對部分樣品用營養瓊脂進行細菌總數測定 ，選取13種細菌總數為0的無菌樣品。無菌樣品用生理鹽水作1：10稀釋，各挑取新鮮菌種的菌苔置生理鹽水中製成含菌量約30—300 cfu／ml的稀釋液，各取一定量加到已經10倍稀釋的上述13種樣品中，混勻，然後各取l ml傾注法分別接種於上述4種培養基的平板上，各接種3個平板，37℃，培養24 h。實驗次數為1次，3個重複。

3．實際樣品檢測實驗：4種樣品分別用生理鹽水作連續10倍遞減稀釋，選擇合適稀釋度的樣品液各取0．1 m1分別塗布法接種到上述4種培養基的平板上，各接種3個平板，37℃ ，培養24 h。我們將采用乳糖發酵管(GB／T 4789．3-2003)法，挑取每個培養基平板上10個具有典型特征的菌落分別接種到乳糖發酵培養基，37℃ ，培養24 h，觀察產氣情況，並進行革蘭染色，對大腸菌群進行確認 。采用商檢法(SN 0169-92)法，從CCEA平板、Agar I平板和Agar II平板上分別挑取10個具有典型特征的菌落分別用一定量的生理鹽水稀釋，分別接種於月桂基硫酸鹽胰腖(LST)肉湯、色氨酸肉湯(靛基質試驗)、Koser枸櫞酸鹽肉湯和MR-VP培養基上，37℃ ，培養24 h，VP和LST實驗培養48 h，MR和Koser枸櫞鹽實驗培養96 h，並同時進行革蘭染色，對大腸杆菌進行確認。符合率為經驗證為大腸菌群或大腸杆菌的菌落數與顯典型色澤的菌落數之比。實驗次數為1次，3個重複。

結 果

1．測試菌株在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II上培養結果比較：在CCEA平板上，大腸菌群和大腸杆菌菌落生長的典型性狀分別為橙紅色和藍綠色；在VRBA平板上，大腸菌群和大腸杆菌生長菌落的典型性狀均為紅色；在Agar I平板上，大腸菌群和大腸杆菌生長菌落的典型性狀為粉紅色和綠色；在Agar II平板上，大腸菌群和大腸杆菌生長菌落的典型性狀為淡藍色和橙紅色。

7種大腸菌群可以在這4種培養基上正常生長，並表現出典型特征；因這4種培養基均具有良好的選擇性，3種革蘭陽性細菌在這4種培養基上均不能正常生長情況；鼠傷寒沙門菌為革蘭陰性細菌，均可在這4種培養基上正常生長，但不表現出大腸菌群典型的性狀，可以與大腸菌群相區別。

對7種大腸菌群在CCEA和其他3種培養基上生長的菌落平均數進行t檢驗分析，CCEA與VRBA和Agar II比較無統計學意義(P>0.05)；CCEA比Agar I長出菌落數略多，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2．模擬樣品在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II上檢測結果比較：對13種無菌樣品中添加的大腸菌群在CCEA和其他3種培養基上生長的菌落平均數進行t檢驗分析，CCEA比VRBA長出菌落數略多，差異有統計學意義(P<0.05)；CCEA與Agar I和Agar II比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

3．實際樣品中大腸菌群和大腸杆菌在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II上檢測結果比較：對4種實際樣品中的大腸菌群在CCEA和其他3種培養基上

表1 七種大腸菌群在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II培養基上培養結果

注：查表t(6)_0.05=2.45，上表t值大於2.45，則表示檢驗差異有統計學意義；反之，t值小於2.45，則表示檢驗差異無統計學意義。^a表示CCEA稍好.

表2  l3種模擬樣品中的大腸菌群在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II培養基上培養結果

注：查表t(12)_0.05=2.18，^a表示CCEA稍好。

生長的菌落平均數進行t檢驗分析，CCEA與VRBA、Agar I和Agar II比較差異無統計學意義(P>0.05)；大腸菌群經驗證總體符合率分別為90％、71.88％、86.25％和81.25％ ，即符合率大小為CCEA>Agar I>Agar II>VRBA。在檢驗樣品雞肉時，在Agar I平板中，除顯色的大腸菌群外，還有52.7％是無色菌，經國標法進行驗證，證明這52.7％的無色菌均為大腸菌群，故用Agar I檢測實際樣品雞肉時，顯色的大腸菌群有0.97×10⁵cfu／g，加上不顯色的大腸菌群共有2．05×10⁵cfu／g，即用Agar I檢測實際樣品雞肉時，會存在嚴重的漏檢(表3)。

對兩種實際樣品中的大腸杆菌在CCEA和其他兩種培養基上生長的菌落平均數進行t檢驗分析，CCEA與AgarI和AgarII比較差異無統計學意義

表3 四種實際樣品中的大腸菌群在CCEA、VRBA、Agar I和AgarⅡ培養基上培養結果

注：查表t(3)_0.05=3.18，括號內為加上不顯色的大腸菌群數量和t值

(P>O.05)；大腸杆菌經驗證總體符合率均為100％(表4，圖1)。

表4 兩種實際樣品中的大腸杆菌在CCEA、Agar I和Agar II上培養基培養結果

注：冰棍和冰淇淋樣品中未發現有大腸杆菌。查表t(1)_0.05=12.7

本實驗室試製的顯色培養基CCEA優於經典方法VRBA，與國外同類產品Agar I和Agar II相比，檢驗效果差異無統計學意義。

討 論

顯色法可直接觀察菌落顏色，可以把檢測、計數和鑒定一次完成。這些基於酶的實驗方法具有簡便、快速、準確和檢出率高的優點。從上述4種實際樣品SN法與顯色法比較檢測所得到的菌落數和符合率數據可見，再次驗證了顯色法的優點。在用顯色法檢測上述實際樣品時，在驗證過程中，測試菌株陰溝腸杆菌產氣慢，40～48 h才會產氣，實際樣品中出現一些可疑菌落在乳糖發酵管生長時超過24 h後才產氣，但經鑒定為大腸菌群，如用國標MPN法時會判定為大腸菌群陰性，因此國標MPN法有存在漏檢的情況。由於大腸杆菌O157不具有大多數大腸杆菌所具有的β-D-葡萄糖苷酶，因此其在CCEA、Agar I和AgarlI平板上生長時並無大腸杆菌的特性，不能與非大腸杆菌的大腸菌群區分，如要求檢測大腸杆菌O157時，應選用其他的培養基。

作者：盧勉飛 吳清平 蔡芷荷  何天文

參 考文 獻

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