微生物培養基質量控製技術和標準

摘要：微生物培養基的酸堿度、凝膠強度和選擇性等直接影響到培養基的質量，在理化試驗方法中采用連接可滲透陶器型液體接頭的電極和平頭電極或者連接微型探頭的電極可分別測定液體和固體培養基的pH值 ，而采用 Gelometer和the LFRA Texture Analyser可測定固體培養基的凝膠強度。在微生物學方法中固體培養基采用傾注平板法、塗布法、劃線法(半定量法)、改良的 Miles-Misra法等測定生長情況，液體培養基采用稀釋法測定生長率，用目標菌和雜菌的混合菌株評價選擇性增菌培養基的選擇性，利用OD值評價液體培養基生長率等。ICFMH (國際食品微生物學和衛生學委員會培養基工作組)、ISO、FDA以及我國衛生部等相繼製定了培養基質量控製的標準，但目前還沒有一個係統的適合我國國情的培養基質量控製國家標準，以致各相關單位采用的標準不一致，所以製定培養基質量控製國家標準非常關鍵。

關鍵詞：培養基，質量控製 ，標準

我國生產培養基已有相當長的曆史，因為培養基種類繁多，生產培養基的廠家也有很多，雖然很多相關單位都有自己的質量控製標準，但到目前還沒有一個係統全麵適合我國國情的國家標準，以致培養基的質量參差不齊，直接影響到很多微生物學實驗結果，所以製定微生物培養基的國家標準非常關鍵。培養基質量控製方法包括理化試驗方法和微生物學試驗方法，其中理化試驗方法包括 pH值的測定 、凝膠強度的測定等，微生物學試驗方法分固體和液體培養基的定量和半定量以及定性試驗。本文就培養基的質量控製做一綜述，為製定培養基質量控製國家標準提供參考。

1 培養基質量控製方法

1.1 理化試驗方法

1.1.1 pH值測定：滅菌前後都應該測定 pH值，采用連接可滲透陶器型液體接頭的電極測定液體培養基的 pH，固體培養基可用平頭電極 (Radiometer A／S，DK-2400 Copenhagen NV，Denmark)或者連接微型探頭的電極(Microelectrodes Inc．，NH03053，U.S.A)測定pH。pH值在滅菌前後均需測定，測量時盡量使培養基溫度降到20℃～25℃，校正通常用接近40g／L的NaOH或者接近36.5g／L(約1mol／L)HC1。

1.1.2 凝膠強度測定：凝膠強度也是一個重要指標，滅菌條件特別是pH會影響凝膠強度。Gelometer(Marine Colloids Inc．，2，Edison Place，Springfield，NJ 0708 1，U．S．A．)和the LFRA Texture Analyser(C．S．Stevens&Son Ltd．Dolphin Yard，Holywell Hill，St．Albans，Herts，U．K．)均能提供良好的測量性能。這種儀器利用直徑為10mm～25mm的圓柱形金屬探頭測量壓破瓊脂表麵時所需的壓力。

一般理化試驗可迅速測出配方中存在的錯誤，而不需等待微生物培養試驗，因此理化試驗是培養基質控的有效手段。

1.2 微生物學試驗方法

1.2.1 質控菌株的保存：一般細菌保存菌種的製備可從質控菌株接種於含5％羊血的胰蛋白腖大豆瓊脂培養基 (TSA)上，在合適的環境和溫度下孵育18—24h，接種以後，通過菌落形態檢查純度和驗證一致性。必要時實施生化試驗。然後製成凍幹菌種，或製成含有10％到15％甘油的防冷凍培養物置於-50％或更低的溫度保存備用。在低於-70％的溫度下菌株可以無限期保存，在-50℃～-70℃僅能保存1年，通常不應在-50℃以上的溫度保存。真菌可用特別製備的馬鈴薯冷凍瓊脂製成斜麵，培養後至-20℃能保存1年。

1.2.2  固體培養基的試驗方法：(1)改良的Miles-Misra法 ：將新鮮菌種用蛋白腖水稀釋；將試驗和對照培養基做成4mm厚的平板並使平板表麵幹燥；對試驗和對照培養基進行係列稀釋度接種，每稀釋度各取4滴分別加入4個試驗和對照培養基；每l滴的塗布超過1／4平板，並用塗布器從高稀釋度開始塗布；培養平板並對數量和菌落形態進行評價。

評價方法：生長率 (productivity ratios，P_R) =N₈／N₀，N₀=對照培養基的菌落數，N₈=試驗培養基的菌落數；m和 M：m表示 80％的菌株需要符合的生長率，M表示100％的菌株需要符合的生長率，滿意的生長率見表1。

表1 滿意的生長率

(2)劃線法 (半定量)  ：平板如圖 l所示，A、B、C區中4條平行線大概相隔

0.5cm，正常情況下，一環從 A區劃到D區。

評價方法：接種以後，評定菌落形態、菌落大小、生長強度和計算生長指數G。每條線都表示1個分數。最大分數是 16。如果隻生長到線的一半就認為數值是0.5。沒有生長或者隻有很少量 (少於一半)的生長，分數0。分數加起來得到G。例如，如果生長到 A區，B區，C區的一半，那麽生長分數G就是10。目標菌株的生長指數應該至少是6。如果是非選擇培養基G。就應該是更高。另外，目標菌株的生長應該是典型的，非目標菌株應該部分或全部被抑製。

(3)定性質控方法：用1ul的接種環在試驗培養基表麵上劃平行線，接種試驗微生物。可以在同一個培養基上不交叉地接種幾種不同的試驗微生物。

評價方法：接種以後的生長情況：0相當於不生長；1相當於弱生長；2相當於強生長。目標微生物的分數應該是 2並且要有典型的特征，大小和菌落形態。非目標微生物的生長應該被部分或全部抑製(0或1)。

1.2.3 液體培養基的試驗方法：(1)目標和非目標微生物的定量稀釋方法：選擇液體培養基 10mL／管待檢；目標微生物的接種：將少量的 (如 10～100cfu／管)試驗菌株接種到試驗和對照肉湯，並混勻；非目標微生物的接種：將大量的 (>l000 cfu／管)試驗菌株接種到試驗和對照肉湯，並混勻；接種目標和非目標微生物作為混合菌種：為了得到混合菌種在選擇培養基上的生長情況，接種少量的 目標微生物 (如 l0～100cfu／管)到試驗肉湯和對照肉湯，並且接種更大量 (>1000cfu／管)的非目標微生物到相同的管中，並混勻；每種肉湯接種培養後塗布到非抑製性培養基平板上。

評價方法：計算目標和非目標微生物的菌落數，用 Pr 和Sf 進行結果的解釋。

Pr (同前所述)：目標微生物的P 應該不小於0.1。

Sf (選擇性因子)的計算如下 ：Sf=Do-Ds.

這裏Do是對照培養基上至少10個菌落的最高稀釋度，Ds是試驗培養基上至少 l0個菌落的最高稀釋度。Sf, Do和Do采用 log10 。為單位來表示。例如：如果 Do 10 =log 4 =4，而 Ds 10-3=log103.0=3，那麽選擇性因子就是 Sf =1.0。非目標微生物的Sf至少應該是2。

在混合菌種中目標微生物不應被非目標微生物抑製，也就是說目標微生物應該是占多數。

(2)利用OD值評價液體培養基生長率：一種自動微生物生長分析儀 Bioscreen microbialogical growth analyzer(Labsystems Oy，Helsinki，Finland)用於比較試驗液體培養基和對照液體培養基培養後微生物的數量，動態測量 OD值，並將數據轉換成生長曲線，該OD值與微生物數量有極好的相關性。這種方法不需作係列稀釋，並且減少試驗材料的需要，是一種便宜、快速和可靠的方法。

2 培養基質量控製標準

2.1 國外培養基質量控製標準  1984年，國際食品微生物學和衛生學委員會培養基工作組 (The International Committee for Food Microbiology and Hygiene，Working Party for Culture Media)(ICFMH，WPCM)提出生物培養基質量控製的標準方案，製定了檢驗培養基質量的導則和標準，其後又補充了工作組發表過的一些專題論文和試驗方法。

美國食品與藥品管理局 (FDA)早在80年代就對培養基製造商建立了生產條例。美國國家臨床實驗室標準委員會培養基質量控製委員會 (The National Committee for Clinical Laboratory Standards，Subcommittee on Media Quality Contro1) (NCCLS)在 1985 年提出並在 1990年通過了導則“M22-A商品微生物培養基質量控製”的標準，1996年修改第二版，2001年修改第三版。

ISO在2000年製定了一份技術規格標準：“ISO／TS 11133-1食品和動物飼料微生物學——製備和生產培養基的導則  第一部分：實驗室製備培養基質量控製的一般導則”。2003年又製定了 “ISO／TS11133-2食品和動物飼料微生物學——製備和生產培養基的導則——第二部分：培養基檢驗規程的應用導則”。

美國藥典和歐洲藥典均對液體硫乙醇酸鹽和胰蛋白腖大豆肉湯兩種無菌檢查培養基進行促菌生長試驗，規定兩種培養基在質控菌少量接種 (10—100cfu)的情況下須生長良好。但沒有對其它培養基進行質控要求，而且質控要求也不夠係統。

2.2 我國培養基質量控製標準  中國微生物學會培養基學組 1990年以來對培養基的原材料和部分商品培養基相繼提出了質控標準。我國衛生部 1993年製定了 “食品衛生微生物檢驗用於燥培養基生產質控和質量標準”；2002年衛生部醫政 司參考 NCCLS標準製定了衛生行業標準：“WS／T232-2002商業性微生物培養基質量檢驗規程”，緊接著2005年中華人民共和國藥典規定了對需氣菌、厭氣菌培養基和真菌培養基3種無菌檢查培養基進行促菌生長試驗。

3 討論

我國衛生行業標準 “WS／T232-2002商業性微生物培養基質量檢驗規程”微生物生長試驗為定性結果，結果的判斷可操作性需進一步提高。美國國家臨床實驗室標準委員會製定的 “M22-A商品微生物培養基質量控製”的標準也有類似情況。而 WPCM將培養基的質控結果定量並分為 5個級別，使結果易於判斷，因此建立的質控標準應該盡可能定量。2001年加拿大對 Ontario的124個實驗室進行考查，得出的結果是大多數實驗室不能完全達到 NCCLS標準的要求，表現為一些培養基根本沒有進行質控，另外一些問題是：沒有采用要求指定的ATCC菌株、培養的溫度和時間不適宜、成品培養基沒有物理特性的檢查記錄、大多數實驗室沒有供應商的控製報告等。因此製定的試驗方法在可得出可靠結果的同時，應考慮我國國情，盡量簡單易行，如果要求較高的操作技術水平或昂貴的設備儀器，則標準難以普及執行。此外，質控菌株的選用還應側重考慮我國食品衛生細菌汙染的實際狀況。質控標準的試驗方法均需要對照培養基進行評價，在我國衛生部 1993年製定了 “食品衛生微生物檢驗用幹燥培養基生產質控和質量標準”中采取 自配的新鮮培養基為對照培養基尚需進一步斟酌，因自配培養基本身不定因素很多，而選用合適的培養基作對照相當關鍵。

由於食品微生物培養基品種較多，而國內可參考的資料不多，國外的一些標準起點可能較高，不一定完全適合我國情況，因此標準和試驗方法的製定工作量較大，可以參考 ISO標準，將製定標準分為兩步，首先製定一般導則，再製定標準和試驗方法。ISO標準的一般導則較為係統，從生產商的產品供應到實驗室製備、產品使用、產品銷毀和最終產品的質量控製等各方麵和各環節均作出了詳細規定，可作為我國製定微生物培養基質控標準的重要參考。

作者：吳清平  孟凡亞  蔡芷荷  劉秀梅  楊 寧

參 考 文 獻

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