聚合酶鏈式反應(PCR) PCR技術因具有簡便、快速、敏感性高和特異性強的優點,現已廣泛應用於微生物檢測、遺傳病診斷等諸多領域。引物設計是利用:PCR檢測沙門菌成功與否的關鍵,用來設計PCR引物的基因主要分3類,即屬特異性引物基因、血清群特異性引物基因與血清型特異性引物基因。屬特異性引物基因。
①hut基因——編碼組氨酸轉運操縱子。黃金林等根據其基因序列設計引物,建立了檢測沙門菌的PCR方法,對沙門菌A~F各群種15株沙門菌、27株沙門菌現場分離株和其他10株非沙門菌菌株進行了擴增,結果沙門菌均顯示出500bp大小的特異性條帶,所有對照均不出現特異條帶,顯示了優良的屬特異性。
②inv基因簇——編碼吸附和侵襲上皮細胞表麵蛋白。ZnU基因簇與沙門菌對腸道上皮細胞的侵襲有關,包括invA、invB、invC、invD、invE等基因。眾多研究者均證實基於;inv基因簇設計的引物具屬特異性,可用於鑒別沙門菌。李業鵬等根據invA基因設計引物,優化了PCR檢測條件,建立了檢測沙門菌屬的PCR檢測方法,並進行了人工汙染沙門菌的食品(生肉、雞蛋、火腿腸等)中沙門菌PCR檢測方法的應用性研究。
③hilA基因——編碼侵襲基因正調節蛋白。hilA是inv基因的正轉錄調節蛋白。
④fimA基因——編碼1型菌毛主要的亞單元。fimA基因編碼沙門菌工型菌毛主要的亞單元,介導與上皮細胞表麵的特異受體相結合。H.J.Cohen等根據fimA基因設計特異引物,檢測出牛奶等食品中的沙門菌。
⑤hns基因——編碼與蛋白質結合的DNA。hns基因編碼與蛋白質結合的DNA。
⑥spy基因——編碼沙門菌毒性質粒相關的毒力因子。spy基因編碼與沙門菌毒性質粒相關的毒力因子,與沙門菌的致病性有關。J.Mahon等根據鼠傷寒沙門菌spvR基因設計引物,特異性檢測到具有該毒力相關基因的沙門菌,而不含質粒和質粒無該毒力相關基因的菌株則表現陰性。
⑦16SrRNA基因。李君文等將常規PCR與半套式PCR相結合,以沙門菌中最保守的16SrRNA基因為模板設計了一對沙門菌屬的特異性引物,經過優化反應條件,敏感性提高到3CFU。血清群特異性引物基因(rfb基因)編碼沙門菌的菌體抗原(O抗原)。O抗原與沙門菌對宿主細胞的黏附、侵襲和在宿主細胞間擴散有關,是沙門菌主要的致病因子之一,刺激機體產生IgM抗體。目前沙門菌屬分為A~Z、051—063、065—067等46個血清群。Luk等根據rfb基因序列分別設計群特異性引物,成功用於A、B、C2、D群沙門菌的檢測。血清型特異性引物基因(沙門菌)的H抗原(鞭毛抗原)本質是蛋白質,是沙門菌重要的毒力因子,決定其對宿主細胞表麵的吸附、侵入和定居過程,刺激機體產生IgG抗體。沙門菌的H抗原分為H1相和H2相,根據O抗原的不同分為46個血清群,各血清群再根據H抗原各相的不同而分成不同的血清型。八匯基因——編碼H1相抗原。H1相又稱特異相,特異性高,大多數沙門菌都具有HI相抗原, 目前型特異性引物的設計多是針對該基因。Wei等測出沙門菌幾種不同的fliC基因序列,經序列對比分析後將沙門菌的fliC基因分為8個區,其中工區和Ⅷ區的保守性達到100%,李景鵬等利用自行設計的工區引物擴增沙門菌,證實該引物具有屬特異性。此外對PCR擴增產物進行限製性內切酶酶切,進行限製性片段長度多態性分析(RFLP)也可區分不同的血清型。
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