1.試管凝集試驗
采集臨床血清,預先稀釋,取每份預先稀釋好的4個不同稀釋度的受檢血清分別加入4個凝集試驗管內,每管o.5ml,加0.5ml 20倍稀釋的抗原於受檢血清各試管內,並振搖均勻:置3;一40℃溫箱24h,取出檢查並記錄結果。牛、馬、鹿和駱駝1:100血清稀釋度,鍺、山羊、綿羊和狗1:50血清稀釋度出現“++”以上凝集現象時,受檢血清判定為陽性;牛、馬、鹿、駱駝1;50血清稀釋度,豬、山羊、綿羊、狗1:25血清稀釋度出現“++”以上凝集現象時.受檢血清判定為可疑反應。經3-4周後重檢,如果仍為可疑,該牛、羊判為陽性:豬和馬經重檢仍保持可疑水平,而牲畜沒有臨床症狀和大批陽性患畜出現,該畜被判為陰性;豬血清偶有非特異性反應,須結合流行病學調查判定,必要時應配合補體結合試驗和鑒別診斷。排除耶爾森菌交叉凝集反應。
2.補體結合試驗(CFT)
補體結合試驗操作複雜,需有良好的實驗設施和訓練有素的人員作準確地滴定和保存試劑,盡管如此,該試驗仍在廣泛使用,而且還是公認的確診方法。指示係統是2.5%一3%的已用等體積兔抗綿羊紅細胞的血清(溶血素)致敏過的新鮮或以前保存的綿羊紅細胞懸液(SRBCs)。試驗前血清要滅活,可使用96孔U形板進行具體操作。
第1排一第3排每孔加25rtl稀釋的被檢滅活血清,第2排為每份血清的抗補體對照。第一排各孔不加抗原,加入CFT緩衝液(抗補體對照)。除第2排外其他各排每孔加25ul CFT緩衝液。從第3排取稀釋血清25rtl向後連續作係列倍比稀釋。
除第1排外每孔加入25uL稀釋至工作濃度的抗原和稀釋至含所需單位的補體。
對照孔設置 隻有稀釋液,陽性血清+補體+稀釋液,抗原+補體十稀釋液和補體十稀釋液。每一種對照總體積都設定為75uL。每一次試驗中都設有能發生最小陽性反應的血清對照,用以檢測試驗條件的敏感性。
微量板於37℃孵育30rain或4℃過夜,每孔加25ltl或50rtl致敏sRBC懸液,微量板於37℃再孵育30rain。
微量板在4℃條件下1000g離心10min或4℃放置2~3h,使未溶解的紅細胞下沉,溶血程度與相當於0、25%、50%、75%和100%溶血標準進行對比,判讀結果。第1排檢測每份血清的抗補體活性缺失情況。
結果解釋 當滴定結果等於或大於20個國際補體結合單位(1CFUT)時結合補體呈陽性,血清判為陽性。在3-6月齡時曾用牛種布氏杆菌19株免疫過的母畜,如果在其18月齡或更大時進行檢測,其血清滴定等於或大於301CFTU/m1則判定其為陽性。
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