植物病毒血清學檢測—酶聯免疫吸附技術(ELISA):(Fab')-ELISA

二.實驗材料和用具

   1.專化性抗體免疫球蛋白IgG(濃度約為1mg/ml)

   2.係統感染病毒的植株和健康植株

   3.酶標記羊抗兔抗體球蛋白IgG(市售)或A蛋白標記的堿性磷酸酯酶(Sigma產品)。

   4.酶聯板、微量加樣器、洗瓶、酶聯讀數儀

   5.抗原包被緩衝液、洗滌緩衝液、IgG稀釋緩衝液、底物溶液

三.實驗步驟

   1.配製緩衝液
    (1).抗原包被緩衝液(0.05M碳酸鹽緩衝液，pH9.6)
    Na2C031.59g；NaHCO32.93g；NaN30.2g蒸餾水加至1升。

    (2).洗滌緩衝液(0.02MPBS-吐溫緩衝液，PBS-T，pH7.4)
    NaCl8.0g ；Na2HPO4 '12H2O2.9g；KH2PO4 0.2g； 
    KCl0.2g；NaN30.2g；蒸餾水加至1升後加Tween-200.5ml.

    (3).IgG稀釋緩衝液(0.02MPBS-T，牛血清白蛋白溶液)
    取0.1g牛血清白蛋白溶於用滅菌蒸餾水配製的PBS-T緩衝液100ml中即成。
    (4).底物溶液(鄰苯二胺溶液)
    a液：檸檬酸19.2克加水溶至1000ml為0.1M檸檬酸溶液
    b液：Na2HPO4.12H2O71.6g加水溶至1000ml為0.2MNa2HPO4溶液。 
    取a液24.3ml加b液25.7ml混合即成磷酸鹽-檸檬酸緩衝液pH5.0 。
    稱取40mg 鄰苯二胺，溶解後過濾，加上述緩衝液至100ml ，臨用前加30 ％H2O2 0.15ml即成(注意鄰苯二胺也需新鮮配製)。

    (5).堿性磷酸脂酶底物緩衝液：
二乙醇胺緩衝液：二乙醇胺97ml，蒸餾水800ml，混合，用濃HCl調pH=9.8 ，加水至1000ml。取硝基酚磷酸pNPP60mg溶於100ml上述二乙醇胺緩衝液中，即為底物緩衝液(現配現用，時間長了會變色)。
    堿性磷酸脂酶標記的A蛋白(Sigma產品)，溶於1.0ml50%甘油中即可使用。 
    2.取顯症葉片和健康葉片用抗原包被緩衝液分別配製1 ∶10，1 ∶100，1 ∶1000 樣品懸浮液，過濾或低速離心後備用。
    3.按設計(同實驗三)在酶聯板上加樣，每孔200 μl，(Fab')2 以1/2000-4000的比例稀釋在50mM包被緩衝液(pH9.6)中；在30℃下孵育四小時，或4℃過夜(時間長，包被好)；
    4.洗板三次同實驗三；
    5.樣品稀釋在提取緩衝液中，4℃下孵育過夜；洗板同前；
    6.IgG(可用未純化的抗血清) 以1/2000-4000的比例稀釋在提取緩衝液中，30℃孵育三小時，洗板同前；
    7.酶標A蛋白以1/2500比例稀釋在提取緩衝液中，30℃孵育三小時，洗板同前；
    8.加底物，室溫孵育不超過30分鍾(過氧化物酶)，2-4小時(堿性磷酸酯酶)，用酶聯免疫檢測儀測定結果。