一．目的
負染方法是在分子水平上闡明病毒質粒細微結構的一種常用方法，在電鏡生物樣品製備中以快速、簡便、用量少和反差大效果好而成為一項普遍應用的重要方法。通過幾種負染法的實驗，初步掌握病毒病的快速診斷方法。
二．基本原理
高密度重金屬鹽類染色劑對蛋白質不能染色，因此可在病毒粒子周圍的背景處沉積下來，造成很強的電子散射而形成較暗的背景，病毒粒體易被電子束穿透成為亮的物體，如同照片的底片（負片）一樣，這種染色方法被稱為負染。
三．主要儀器、用具及藥劑
儀器：電鏡、超淨工作台、溫箱、冰箱、萬分之一天平、酸度計、顯微鏡。
藥劑：磷鎢酸、醋酸雙氧鈾、戊二醛、冰乙酸、聚乙烯醇縮甲醛(Formvar)、氯仿（三氯甲烷）、無水乙醇、雙蒸水。
用具：載玻片、工具盒,銅網、鑷子、單麵刀片、手術剪、滴管、Parafilm膜、蠟片、培養皿、濾紙,小燒杯，白瓷盤、滴瓶及蒸溜水、圓頭玻棒、250 目銅網、平底皿、卡片紙、5ml量筒、玻璃條、鉛筆。
三．實驗材料
提純的煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)或其它提純病毒，病毒侵染的病葉
四．實驗步驟
（一）.提純病毒的負染色
第一種方法：
1.將提純的ＴＭＶ懸液用蒸餾水進行1：10或1：100的稀釋；
2.用鑷子夾持銅網，滴管吸取樣品加在銅網上，稍待片刻，用濾紙片從銅網邊緣吸掉餘液；
3.待銅網上的液體將幹未幹時，立即滴一滴2-3 ％磷鎢酸負染色液，注意不能使銅網背麵粘上液體。1～2分鍾後，用濾紙吸掉餘液，自然幹燥；
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4.將染好的銅網放在培養皿中，作好記錄，37 C溫箱中幹燥0.5～1小時即可進行電鏡觀察。
第二種方法：
1.將提純的CMV懸液與1％戊二醛固定液按10：1比例在蠟片上混合（戊二醛最終濃度為0.1％)，固定10～15分鍾；
2.用鑷子夾持銅網，沾取樣品懸液，稍待片刻；
3.用滴管吸取雙蒸水，連續洗滴銅網，洗掉戊二醛固定液等，清洗完畢後用濾紙吸掉餘液。
4.待銅網上液體將幹未幹時，漂浮在1％醋酸鈾或3 ％磷鎢酸負染色液滴上，1～2分鍾後取出銅網，用濾紙吸掉餘液。
5.將染好的銅網放在培養皿中，37 ℃溫箱中幹燥0.5～1小時即可。
（二).植物病毒浸出法負染色
第一種方法：
1.在載玻片上滴一滴雙蒸水或0 ·005M磷酸緩衝液；
2.將一小片植物病葉放置於液滴中並用刀片切碎，讓病毒釋放到液滴中；
3.夾持銅網，沾取浸出液，稍待片刻，用濾紙吸掉餘液；
4.再如上述相同方法進行染色。
第二種方法：
1.將凹玻片中加幾滴雙蒸水或2 ％磷鎢酸負染色液；
2.取一小片植物病組織剪碎並在液滴中充分研細；
3.吸液滴到載玻片；
4.用鑷子夾持銅網倒扣到載片玻璃上，然後按上述相同方法進行染色。若浸出液中植物殘渣過多，可先用雙蒸水對銅網滴洗後再進行負染色。也可將組織浸出液經低速離心（2000～4000rpm)後，沾取上清液進行染色。）
第三種方法：
1.在取材前一天，將供試材料澆足水分。取材時選有代表性的病葉剪下，將幾張病葉重疊到一起，一手捏緊，另一手持鋒利刀片，將幾張葉片同時割破，此時破口處將有汁液滲出。
2.用尖細鑷子夾住帶膜銅網，使膜麵朝向破口處，輕輕沾取汁液至銅網上
3.待銅網汁液將幹未幹時，將吸取負染液的毛細管呈45o角插入鑷子兩臂的間隙中間，輕而慢地滴加負染液。使染液經過帶膜銅網上而隨即流逝。
4.待銅網上染液停留3～5分鍾，吸去餘液。
5.37℃溫箱中幹燥0.5～1小時後電鏡觀察。
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