微生物在自然界中都是混雜地生活在一起，要想研究和利用某種微生物，須把它從混雜的微生物群中分離出來，以得到隻含該種微生物的培養物。微生物學中，將在實驗室條件下從一個細胞或一種細胞群繁殖得到的後代稱為純培養（pure culture）。分離純培養的方法通常有以下幾種：
1．稀釋法
（1）平皿傾注法
（2）平板塗布法 預先製備平板。然後製備並吸取適度稀釋的菌液，滴於各平板中央（每皿一滴，約0.05ml），用無菌刮刀將菌液均勻塗布於平板表麵。
2．平板劃線法 劃線的方式很多，其目的都是使平板上菌體逐漸變稀，最終形成單菌落。劃線用平板也要預先製備。常用的是以下兩種方式：
（1）針尖稍彎的接種針火焰滅菌並冷卻後，取樣；在靠近平皿邊緣處的平板上，將針尖的彎曲部位接觸平板，接種棒與平板麵成30°～40°角，劃3條～4條平行線；轉動平皿約50°角，灼燒接種針，冷卻後，通過前一區劃2條～3條平行線，並繼續劃2條～3條不通過前一區的平行線；再轉動平皿……如此劃4區～5區（圖3—5A）。此種方法適用於分離純化固體培養基上的培養物。
（2）灼燒並冷卻的接種環取樣後，在平板上作連續劃線（圖3—5B）。此適用於液體樣品。
3．單細胞挑取法 把一滴菌懸液置於載玻片上，用安裝在顯微鏡挑取器上的極細的毛細吸管，在顯微鏡下對準某一個單獨的細胞吸取，再接種於培養基上培養。此法限於高度專業化的科研。
4．利用選擇培養基分離法
（1）采用選擇性高的培養基 例如，以纖維素為唯一碳源，分離分解纖維素的微生物；用無氮培養基分離自生固氮菌；在15ml培養基中加25％乳酸1滴～2滴以抑製細菌生長，把受細菌汙染的黴菌分離出來。
（2）培養基中加抑製劑 例如，結晶紫10mg/L可抑製G+細菌生長，利於分離G-細菌；KMnO4100mg/L抑製細菌和黴菌生長，利於分離放線菌；製黴菌素50mg/L或放線酮50mg/L利於分離純化放線菌；分離純化黴菌或放線菌時，加鏈黴素30mg/L、金黴素2mg/L可抑製細菌生長。
5．其他 如，高溫處理（80℃ 15min或100℃ 10min）分離芽孢杆菌；4％KOH處理痰液，分離結核杆菌等等。
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