（一）檢驗
1、增菌培養
取回的樣品應在4℃下處理、存放和運送，如果是冷凍樣品，則在檢驗前要保持冷凍狀態。
取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質杯中進行均質，然後轉入三角瓶中，30℃培養4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮，繼續培養20h和44h.。
2、分離
共培養24h和48h後，取EB培養物分別在OXA和LPM或加七葉苷/Fe3+LPM瓊脂平板上劃線。PALCAM瓊脂可替代LPM瓊脂。將OXA和PALCAM平板置於35℃培養24-48h，LPM平板在30℃培養24-48h。然後，把LPM平板放於解剖鏡載物台上，以450角入射光從平板下麵照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對照。
加入七葉苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光係統，選擇可疑菌落的方法與在OXA上選擇可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周圍有一個黑色環，其它菌也可形成黑色環，但形成時間要在兩天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。
在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5個或更多的典型菌落，分別劃線於TSAYE平板上以得到更純、更典型的單個菌落。食品檢驗中在TSAYE平板上純化是必須的，因為在PALCAM和OXA或LPM平板上分離菌落時可能沾有不可見的受抑微生物。挑取5個典型菌落的原因是一個樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培養24-48h，如果不用於動力觀察，也可在35℃培養。
3、鑒定步驟
（1）觀察TSAYE平板通過斜射光觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對照。
（2）、從30℃或更低溫度下培養的TSAYE平板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液製成。如果菌量太少，菌體黏附於載玻片上而呈現非運動性。李斯特氏菌是細短杆菌，可見輕微的旋轉及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對照相比，球形、大的杆狀且快速泳動的都不是李斯特氏菌。
（3）挑取典型菌落進行過氧化氫酶實驗，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應。
（4）取16-24h的培養物進行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽性杆菌。但是陳舊培養物革蘭氏染色會發生變化，而且菌體可成球形。在染色過重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢，易誤認為白喉菌而錯判。
（5）挑取典型菌落接種於TSBYE肉湯管中，35℃培養24h用做糖類發酵和其它生化項目實驗。TSBYE肉湯管在4℃下可存放幾天，也可反複接種。
（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺種到5%的綿羊血或馬血瓊脂平板上，刺種時避免觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時設陽性對照（單核細胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對照（英諾克李斯特氏菌），35℃培養48h。單核細胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血環。
（7）在明亮的光照下，觀察經穿刺的血瓊脂平板，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點產生較清晰的β-溶血環，英諾克李斯特氏菌不產生溶血現象，而綿羊李斯特氏菌產生界限明顯的較大溶血環，在此不要試圖進行種間的區分，但要記錄下溶血反應的特征，CAMP試驗可區分它們間的溶血反應。
（8）硝酸鹽還原試驗（選做）。用TSBYE肉湯培養物接種於硝酸鹽肉湯中，35℃培養5天後，加入0.2mL試劑A，再加入0.2mL試劑B，混合，出現紫紅色為陽性反應，表明硝酸鹽已被還原，如無顏色出現，在試管內再加入少量鋅粉，放置1h，如出現紫紅色，表明硝酸鹽仍存在，未被細菌還原。隻有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽，因此，從格氏李斯特氏菌中區分出默氏李斯特氏菌就必須進行這唯一的試驗。本試驗還有一等效試驗，即加入0.2mL試劑A後，再加入0.2mL試劑C，出現橙色表明硝酸鹽已被還原。如未出現顏色反應，也加入少量鋅粉，若出現橙色表明硝酸鹽未被還原。
（9）將TSBYE培養物穿刺到SIM和MTM試管中，室溫培養7天，每日觀察，李斯特氏菌呈典型傘狀生長。在MTM中傘狀生長更典型。同時，30℃的TSBYE培養物在油鏡下可見細菌作翻轉運動。
（10）將TSAYE肉湯培養物分別接種於0.5%（W/V）葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發酵管內（可選用倒立發酵管），35℃培養7天，呈陽性反應的李斯特氏菌產酸不產氣，李斯特氏菌發酵鼠李糖和木糖的情況見下表。所有李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖均能發酵，除格氏李斯特氏菌均不能發酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七葉苷/Fe3+的LPM分離平板上菌落色素很明顯，則七葉苷試驗可免做。
李斯特氏菌屬的區別
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種別 |
溶血 |
硝酸鹽 |
糖發酵 | ||
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甘露醇 |
鼠李糖 |
木糖 | |||
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單增李斯特氏菌 |
+ |
- |
- |
+ |
- |
|
英諾克李斯特氏菌 |
- |
- |
- |
V |
- |
|
威爾斯李斯特氏菌 |
- |
- |
- |
V |
+ |
|
西爾李斯特氏菌 |
+ |
- |
- |
- |
+ |
|
格氏李斯特氏菌 |
- |
- |
+ |
V |
- |
|
綿羊李斯特氏菌 |
+ |
- |
- |
- |
+ |
V:反應不定
4、血清學鑒定
下表顯示了李斯特氏菌種間的血清學關係。
李斯特氏菌的血清學關係
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種別 |
血清型 |
|
單增李斯特氏菌 |
1/2A、1/2B、1/2C、3A、3B、3C、4A、4AB、4B、4C、4D、4E、“7” |
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綿羊李斯特氏菌 |
5 |
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英諾克李斯特氏菌 |
4AB、6A、6B、Un（未確定） |
|
威爾李斯特氏菌 |
6A、6B |
|
西爾李斯特氏菌 |
1/2B、4C、4D、6B、Un（未確定） |
將TSBYE肉湯培養物接種到3mLTSBYE肉湯中，35℃培養24h，接種2支TSAYE瓊脂斜麵，35℃培養24h。用3mL0.01mol/l磷酸鹽緩衝液將斜麵菌苔洗下，菌懸液於80℃水浴中加熱1h，以2500r/min離心30，棄去2mL上清夜，將剩餘液與沉澱混勻製成菌懸液，進行血清學玻片凝集試驗。
5、小鼠毒力試驗
將分離的菌株接種到10 mL TSBYE肉湯中，35℃培養24h，將培養物離心、濃縮，用1mL生理鹽水製成菌懸液（濃度為1010個菌/mL），取0.1mL腹腔注射體重為16-18g 小鼠，每組5個觀察7d內小鼠死亡情況。用已知致病的單增李斯特氏菌和非致病的英諾克李斯特氏菌相同方法進行，做對照試驗。
6、協同溶血（CAMP）試驗
在羊血瓊脂平板上平行接種β-溶血金黃色葡萄球菌（S.aureus）和馬紅球菌(R.equi),在它們中間垂直劃線接種可疑菌，與兩線相近但不相交，在30℃培養24h-48h,檢查平板中垂直接種點對溶血環的影響。靠近金黃色葡萄球菌接種點的單增李斯特氏菌的溶血增強，西爾李斯特氏菌的溶血也增強，綿羊李斯特氏菌在馬紅血球附近的溶血增強。
（二）控製
單增李斯特氏菌在一般熱加工處理中能存活，熱處理已殺滅了競爭性細菌群，使單增李斯特氏菌在沒有競爭的環境條件下易於存活，所以在食品加工中，中心溫度必須達到70℃持續2分鍾以上。
單增李斯特氏菌在自然界中廣泛存在，所以即使產品已經過熱加工處理充分滅活了單增李斯特氏菌，但有可能造成產品的二次汙染，因此蒸煮後防止二次汙染是極為重要的。
由於單增李斯特氏菌在4℃下仍然能生長繁殖，所以未加熱的冰箱食品增加了食物中毒的危險。冰箱食品需加熱後再食用。
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