1、樣品的儲存和運送:
如樣品不能立即進行檢驗時,應在樣品中加等量緩衝甘油--氯化鈉溶液(液體食品應加雙料的),將樣品做低溫保存,直到檢驗,運送樣品時,應使樣品保持冷凍狀態,並要避免容器消損。
2、將解凍樣品取25g移入滅菌的均質杯,並加入0.1%蛋白腖水225mL,低速攪拌1-2分鍾,使之均質化,作為1:10稀釋液,以上1:10稀釋的均質液,按1mL加入0.1%蛋白腖水9mL,作做成10-2--10-6的係列稀釋液,(如為液體樣品則可吸取25mL加入盛有225mL稀釋劑的500mL稀釋並搖勻,再作10倍遞增稀釋即可)。
傾注不含卵黃的TSC瓊脂倒10個滅菌平皿中,每皿約5mL,並迅速旋轉平皿,使瓊脂凝固後,將每個平皿編號標記,以無菌操作,吸取稀釋樣品1mL分別加到每個瓊脂平板表麵中心,再向平皿傾注不含卵黃的TSC瓊脂15mL,緩慢地旋轉平皿,使其與接種物混合均勻.也可用滅菌L棒,將0.1mL樣品稀釋液均勻地塗布於不含卵黃乳液的TSC瓊脂上,將平板水平靜置5-10分鍾,使接種物被吸收,然後用不含卵黃的TSC瓊脂10mL覆蓋平板表層,瓊脂凝固後,將平板置於厭氧罐內於36+1℃,培養20小時,取出平板,用肉眼觀察生長情況和有無黑色菌落,挑選有20-200個黑色菌落的平板進行記數，產氣莢膜梭菌的菌落一般呈黑色。
3、證實:
從可記數的平板(具20-200個菌落)中挑選10個典型菌落,分別接種到液體硫乙醇酸鈉培養基試管中,於36±1℃,培養18-24小時,取培養物塗片,作革蘭氏染色鏡檢,檢查培養物的純度和細菌形態,產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性,粗短的梭狀芽胞杆菌.對於被汙染的培養物可劃線接種在含有卵黃的TSC瓊脂平板上,於厭氧條件下以36±1℃,24小時培養,以獲得純培養物。
上述培養物,以接種針穿刺接種動力,硝酸鹽培養基36±1℃厭氧培養24小時觀察有無動力,滴加甲萘胺液和對氨基苯磺酸液各0.5mL,觀察硝酸鹽是否被還原,取生長旺盛的硫乙醇酸鈉培養液1mL接種含鐵牛奶培養基,厭氧培養過夜或46℃2-5小時觀察有無暴烈發酵現象,但培養基不變黑,將培養液點種卵黃瓊脂平板(每個平板至少可點種10點),倒置厭氧培養裝置內36±1℃培養24小時,觀察接種點,產氣莢膜梭菌產生卵磷脂酶,分解卵黃中的卵磷脂,使接種點的底部及周圍形成乳白色的渾濁帶.此外還可作明膠液化及含1%水楊甙和含1%棉子糖的發酵試驗等,對上述四項主要生化試驗,全部符合者即可確定為產氣莢膜梭菌。
4、結果解釋及報告:
樣品中產氣莢膜梭菌的計算,基於被證實為產氣莢膜梭菌菌落的百分數(例如10‐4稀釋的平板中,平均有85個菌落,10個菌落中,有8個被證實為產氣莢膜梭菌,那麽每1g食品中產氣莢膜梭菌數即為85×(8/10)×10000=680000),報告產氣莢膜梭狀芽胞杆菌數/g(mL) 。
產氣莢膜梭菌檢驗檢測程序
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檢樣25g(mL)或稀釋液225mL
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TSC瓊脂混合傾注
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黑色菌落記數
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任挑黑色菌落10個,分別接種FT培養基
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確證試驗
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鏡 動 銷 牛 卵
檢 力 酸 奶 磷
形 試 鹽 發 脂
態 驗 還 酵 分
原 解
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菌落計數
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